响应面优化酶促油酸甘油酯化制备甘三酯工艺的研究

徐广维,毕艳兰,刘太宇

(河南工业大学,粮油食品学院,河南郑州 450001)

响应面优化酶促油酸甘油酯化制备甘三酯工艺的研究

徐广维,毕艳兰*,刘太宇

(河南工业大学,粮油食品学院,河南郑州 450001)

采用响应面法对脂肪酶Novozym 435在无溶剂体系中催化甘油和油酸酯化反应合成甘三酯的反应条件进行了研究。结果表明:底物摩尔比、反应时间、反应温度和加酶量都对甘三酯的含量有影响(p<0.05),其中底物摩尔比影响最为显著(p=0.0104)。经过响应面优化得到的最佳反应条件为:底物摩尔比(油酸∶甘油)2.92∶1,反应时间12 h,反应温度98 ℃,加酶量(以占油酸和甘油总质量的百分比计)2.96%。在最优条件下,甘三酯含量可达到90.88%±1.56%,酯化度达到93.09%±1.42%。

Novozym 435,响应面,酯化,油酸甘三酯

油酸甘三酯是一种长碳链单不饱和脂肪酸甘三酯,主要存在于天然油脂中。因其可以作为增稠剂、表面活性剂以及医药原材料等,因此在工业和生活中有广泛的应用[1]。获得油酸甘三酯的途径很多,既可以从动植物油中分离得到,也可由甘油和脂肪酸酯化合成。酯化合成的针对性强,产品纯度高,受到了较多的关注[2-3]。

目前,国内外酯化合成甘三酯的主要方法有化学法和酶法,化学法需要化学催化剂来催化反应,但有很多局限性,如反应温度高,工艺复杂,产品特异性差,污染严重,后期处理成本高等[4]。相比化学法而言,酶法具有很多优点,脂肪酶作为催化剂具有很高的选择性和专一性,反应条件温和,耗能少,产品纯度高,已进行较多的实验室研究[5-10]。孙素玲[5]等研究了在脂肪酶Novozym 435的催化下,游离多不饱和脂肪酸与甘油的酯化合成工艺,当甘油与脂肪酸的质量比0.12∶1,在反应时间48 h、反应温度50 ℃、加酶量与底物游离脂肪酸的比例1∶4(w/w)、初始加水量为0条件下,酯化度达到96.58%。Kaizhou Yang[8]等利用脂肪酶Novozym 435催化辛酸、癸酸和油酸与甘油酯化反应合成中长碳链脂肪酸,在反应温度90 ℃、加酶量(以底物总质量比计)4.80%、摩尔比(脂肪酸∶甘油)=3∶1条件下反应12.37 h,得到甘三酯含量为93.54%。以上文献中制备中长碳链甘三酯均在常压条件下,所用脂肪酶较多(加酶量≥4%),或者反应时间较长(反应时间≥12h),均会增加生产成本。

本研究拟采用甘油和油酸在负压条件下优化脂肪酶Novozym 435催化合成油酸甘三酯的制备条件,旨在减少酶的用量,缩短反应时间,为酶法生产油酸甘三酯的工业化推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油酸(GC)标准样品,单、二、三油酸甘油酯混合标准样品;三硬脂酸甘油酯标准样品(纯度均≥99%) 购自sigma-aldrich(中国);脂肪酶Novozym 435 购自丹麦诺维信公司;油酸(月桂酸2.05%,豆蔻酸0.13%,棕榈酸3.52%,硬脂酸2.47%,油酸78.62%,亚油酸12.51%,亚麻酸0.21%) 购自Aladdin-阿拉丁试剂(上海)有限公司;工业甘油(纯度≥99%) 购自天津市科密欧化学试剂有限公司;正己烷(色谱纯) 购自天津市科密欧化学试剂有限公司;无水硫酸钠(分析纯) 购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

Agilent 7890B气相色谱 美国安捷伦公司;SZCL-A数显智能温控磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司;TW-A4旋片式真空泵 上海树立仪器仪表有限公司;BSA224S分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;DT-1100L电子天平 常熟市金羊砝码仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甘三酯的合成 在设定的底物摩尔比(油酸:甘油,下同)、反应时间、反应温度和加酶量(以油酸和甘油总质量计,下同)的条件下,用脂肪酶Novozym 435催化甘油和油酸酯化合成甘三酯,反应装置及方法根据文献[11]改进。

称取总量为40 g的油酸和甘油(摩尔比按照表1所示)于250 mL三口烧瓶中,加入30 mm梭形转子并插上温度计(温度显示范围0～200 ℃),然后将其固定在设定温度的恒温磁力搅拌器中,连接冷凝装置(直形冷凝管)、接收瓶,之后连接缓冲瓶及真空泵(油泵)。保持一定转速,打开真空泵,使反应温度迅速升至设定温度。然后关闭真空泵,向三口烧瓶中加入一定量的脂肪酶Novozym 435(按照表3所示),开启油泵并计时,按照实验设定的反应时间(按照表3所示)取样检测分析。

1.2.2 样品处理 每次取样量为1滴(约0.013 g),加入1000 μL正己烷(色谱纯)进行溶解,用2.5 mL注射器吸出溶液,经过孔径0.45 μm针式过滤器过滤,缓慢打入另一支干净试管中,加入适量无水硫酸钠除去痕量水分,封口备用。

1.2.3 产物成分定量分析 利用气相色谱仪(高温柱)对产物成分进行检测,分析产物组成并计算各部分质量、相对含量及酯化度[12]。

气相色谱仪分析条件:氢火焰离子化检测器,DB-1ht毛细管柱(30 m×0.25 μm×0.1 μm),柱温100 ℃保持0 min,50 ℃/min升温到220 ℃保持0 min,15 ℃/min升温到290 ℃保持0 min,以40 ℃/min升温到320 ℃保留8 min,以20 ℃/min升温到360 ℃保留12 min,进样口380 ℃,分流比20∶1,检测器温度400 ℃,高纯氮气流速4.41 mL/min,氢气流速30 mL/min,空气流速300 mL/min。

1.2.4 响应面实验 采用Design Expert 8.0.6 软件进行响应面设计,以影响甘三酯含量的四个重要因素底物摩尔比、反应时间、反应温度和加酶量为自变量,分别以A、B、C、D表示,并以-1、0、1分别表示各自变量的低、中、高三水平,以甘三酯含量(TG，%)和酯化度(ED，%)为响应值,研究以上四个因素对甘三酯含量和酯化度的影响,因素与水平见表1。

表1 响应面实验因素与水平

1.2.5 数据处理方法 采用统计学软件SPSS 19.0 对实验数据进行显著性检验及方差分析。p>0.05 表示结果没有显著性差异,p<0.05 表示结果具有显著性差异,p<0.0001表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

脂肪酸、甘一酯、甘二酯和甘三酯标准曲线方程如表2所示。

表2 标样的标准曲线方程

标准曲线方程的回归系数R2均大于0.8000,说明拟合程度良好。根据产物中每种组分的峰面积和标准曲线方程,可计算出产物中各种组分的质量,从而得到其相对含量。

m总=m脂肪酸+m甘一酯+m甘二酯+m甘三酯

酯化度(%)=(1-FFA)×100

式中,FFA为样品中游离脂肪酸的相对百分含量。

2.2 产物组成的定性、定量分析

脂肪酸、甘一酯、甘二酯及甘三酯混标的色谱如图1所示。酯化反应产物的气相色谱如图2所示。

图1 脂肪酸、甘一酯、甘二酯、甘三酯标样色谱Fig.1 The gas chromatogram of the standard sample of FA,MG,DG and TG注:色谱图中1～3.1 min之间的峰为脂肪酸;4～5min之间的峰为甘一酯;10～11 min之间的峰为甘二酯;21～22 min之间的峰为甘三酯。

图2 甘油酯化产物气相分析色谱图Fig.2 The gas chromatogram of the glyceride esterification reaction 注:色谱图中1～3.1 min之间的峰为脂肪酸;4～5 min之间的峰为甘一酯;7～11 min之间的峰为甘二酯;17 min以后的峰为甘三酯。甘油和油酸的反应条件为:温度100 ℃,加酶量3%,反应时间8 h,油酸与甘油的摩尔比为3∶1。

产物中甘一酯、甘二酯、甘三酯以及未反应脂肪酸在气相色谱图中的出峰位置无交错和重叠,因此可以用气相色谱法来检测反应物的含量。

2.3 单因素实验

2.3.1 底物摩尔比 由图3可知,在油酸与甘油的摩尔比为2∶1～3∶1时,随着底物摩尔比的增加,酯化度基本维持90%以上,而甘三酯含量从40.34%±1.69%逐渐增加到92.02%±1.91%。这与油酸和甘油的分步反应有关,即:酯化体系中,油酸与甘油先酯化为甘一酯、甘二酯,最后酯化为甘三酯。当甘油过量时,其主要产物为甘一酯和甘二酯,而甘三酯的含量较少。在摩尔比为4∶1时,由于所加入的油酸过量,使产品中的游离脂肪酸含量很高,导致产品中甘一酯、甘二酯和甘三酯的相对含量均降低,即甘三酯含量和酯化度均降低。综上,较适宜的油酸与甘油摩尔比为3∶1。

图3 底物摩尔比对甘三酯含量和酯化度的影响Fig.3 Effect of substrate molar ratio on triglyceride content and esterification degree注:反应温度100 ℃,加酶量6%,反应时间8 h。不同字母表示有显著性差异,p<0.05。

2.3.2 反应时间 从图4可以看出,随着反应时间的延长,甘三酯和酯化度均先增加后保持不变,在6 h时,甘三酯含量和酯化度分别达到92.85%±1.45%和95.42%±0.68%。6 h之后,反应已经达到平衡,随着反应时间的延长,甘三酯含量和酯化度均无显著性变化(p>0.05)。考虑到使酶充分发挥催化效果,适当延长反应时间,因此,较适宜的反应时间选择8 h。

图4 反应时间对甘三酯含量和酯化度的影响Fig.4 Effect of reaction time on triglyceride content and esterification degree注:反应温度100 ℃,加酶量6%,油酸与甘油的摩尔比为3∶1，标有不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.3.3 反应温度 从图5可以看出,反应温度从60 ℃增至100 ℃时,甘三酯含量和酯化度均显著升高(p<0.05),甘三酯含量高达92.02%±1.91%,酯化度达到94.84%±1.13%。在100～120 ℃时甘三酯含量和酯化度均无显著性变化(p>0.05)。当温度达到140 ℃时,甘三酯含量和酯化度显著下降。这主要和酶的催化温度有关,温度较低时酶的催化活性较低,温度较高时,部分酶丧失催化活性,不能继续催化反应的进行。综上,较适宜的反应温度为100 ℃。

图5 温度对甘三酯含量和酯化度的影响Fig.5 Effect of reaction temperature on triglyceride content and esterification degree注:油酸与甘油的摩尔比为3∶1,反应时间8 h,加酶量6%,标有不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.3.4 加酶量 从图6可以看出,在加酶量为1%和3%时,甘三酯含量随着加酶量增加而显著增加(p<0.05),从78.31%±2.32%增加到89.42%±1.03%;当加酶量增至5%时,甘三酯含量保持不变(p>0.05)。加酶量为1%～5%时,酯化度无明显变化(p>0.05),为94%左右。综上,较适宜的加酶量为3%。

图6 加酶量对甘三酯含量和酯化度的影响Fig.6 Effect of enzyme content on triglyceride content and esterification degree注:脂肪酸与甘油的摩尔比为3∶1,反应温度100 ℃,反应时间8 h，标有不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.4 响应面实验设计及结果

响应面实验设计及结果见表3所示。

表3 响应面实验设计结果

2.5 响应面分析

采用Design Expert 8.0.6 软件对表3中甘三酯含量进行多元回归拟合,得到甘三酯含量对影响因素A、B、C、D的二次多项回归方程:

TG(%)=-638.02+5.14A+229.23B+25.83C+12.84D+0.43AB-0.13AC-0.05AD+6.93BC+0.70BD-1.38CD-0.03A2-47.91B2-2.67C2-0.23D2

酯化度对影响因素A、B、C、D的二次多项回归方程:

ED(%)=94.00+0.74A-5.17B+3.86C+2.78D+0.37AB-1.89AC-0.58AD+2.54BC+2.38BD-4.02CD-1.30A2-3.06B2-3.28C2-1.11D2

回归方程系数显著性检验结果见表4。由表4可以看出,甘三酯含量回归方程p<0.0001,酯化度回归方程p=0.0005,表明甘三酯含量和酯化度的回归方程显著。而甘三酯含量和酯化度的回归方程失拟项p值均大于0.0500,失拟不显著,误差可能是由于随机误差造成的,对实验结果影响较小,因此以上拟合方程可以用来表示真实情况。同时,甘三酯含量和酯化度回归方程的回归系数R2分别为0.9032和0.8716,均大于0.8000,说明拟合程度良好。因此,可以用这两个回归方程对甘三酯含量和酯化度进行分析以及预测。在甘三酯含量的回归方程中,一次项系数B、交互项系数CD以及二次项系数A2、B2、C2均影响显著,说明底物摩尔比对甘三酯含量影响显著,加酶量和时间交互作用对甘三酯含量影响显著。在酯化度的回归方程中,一次项系数B、C、D、交互项系数CD以及二次项系数B2，C2均影响显著,说明底物底物摩尔比、加酶量和反应时间都对酯化度产生影响,加酶量和反应时间的交互作用对酯化度影响显著。

表4 甘三酯含量和酯化度的方差分析

2.5.1 加酶量和反应时间交互作用对甘三酯含量的影响 反应时间和加酶量交互作用如图7所示。固定条件:反应温度100 ℃,油酸与甘油的摩尔比3∶1。

图7 反应时间与加酶量对甘三酯含量的影响Fig.7 Effects of reaction time and enzyme load on triglyceride content

从图7可以看出,最佳反应条件出现在加酶量为3%～5%,反应时间在12 h左右范围内。在加酶量小于3%时,随着反应时间的延长,甘三酯含量逐渐增加。在较大加酶量情况下,甘三酯含量随着反应时间的延长先升高随后保持不变。加酶量和反应时间的交互作用对甘三酯含量的影响显著(p=0.0060),其中加酶量对甘三酯含量的影响p=0.1325,这说明加酶量在酶法酯化合成甘三酯过程中对甘三酯含量影响都不显著。这个结论与Arifin N[9]等的研究一致,其再利用Lipozyme RM IM催化癸酸和硬脂酸的混合酸与甘油酯化反应制备中长碳链甘三酯研究中,发现加酶量对中长碳链甘三酯含量影响不显著,在当酶量大于11%时,甘三酯含量反而降低。

2.5.2 反应温度和底物摩尔比交互作用对甘三酯含量的影响 反应温度和底物摩尔比交互作用如图8所示。固定条件:反应时间8 h,加酶量3%。

图8 反应温度和底物摩尔比对甘三酯含量的影响Fig.8 Effects of reaction temperature and substrate molar ratio on triglyceride content

从图8可以看出,反应温度和底物摩尔比都对甘三酯含量有影响。当反应时间为8 h,加酶量为3%时,甘三酯含量最大值出现在反应温度93～105 ℃,底物摩尔比在2.9∶1～3.3∶1的范围内。在一定温度下,甘三酯含量随着底物摩尔比的增加先升高后降低。这与S. P. Koh[13]在采用Lipozyme RM IM催化癸酸和油酸的混合酸与甘油酯化反应制备中长碳链甘三酯研究中的结论一致,较高的底物摩尔比能增加理论产量,但是脂肪酸过量时,会对反应有抑制作用,使反应达到平衡所需时间延长,甘三酯含量下降。

在底物摩尔比一定的情况下,甘三酯含量和反应温度的变化关系也是如此。这主要是与脂肪酶的最适催化温度有关,反应温度低时,酶未达到最大活性,表现出催化活性较低;反应温度高时,酶失去活性,不能继续催化底物进行酯化反应[14]。

2.5.3 加酶量和反应时间交互作用对酯化度的影响 加酶量和反应时间交互作用如图9所示。固定条件:反应温度100 ℃,油酸与甘油的摩尔比3∶1。

图9 加酶量和反应时间对酯化度的影响Fig.9 Effects of enzyme content and reaction time on esterification degree

从图9可以看出,在加酶量小于3%时,随着反应时间的延长,酯化度逐渐升高;然而,在加酶量为3%～5%时,酯化度随着反应时间的延长先升高后降低。在反应时间小于6 h时,酯化度随着加酶量的增加而不断升高,当反应时间大于6 h时,酯化度随着加酶量的增加先升高随后变化不明显。加酶量和反应时间的交互作用对酯化度的影响显著(p=0.0170),从总体上来看,酯化度的最高值区间为加酶量为3%～5%,反应时间为12 h。

2.5.4 反应温度和底物摩尔比交互作用对酯化度的影响 反应温度和底物摩尔比交互作用如图10所示。固定条件:反应时间8 h,加酶量3%。

图10 反应温度和底物摩尔比对酯化度的影响Fig.10 Effects of reaction temperature and substrate molar ratio on esterification degree

从图10可以看出,酯化度最高值即最适的反应温度在97～109 ℃之间,最佳底物摩尔比在2.5∶1～2.7∶1之间,可达到96%以上。在反应中,酯化度随着底物摩尔比的增加而逐渐减少,由96%降至86%左右,这主要是因为油酸含量的增加使得甘油含量相对减少,造成反应不完全,从而使得反应酯化度降低。当底物摩尔比一定时,酯化度随着反应温度的升高而先增加后降低,这与张超[15]等的研究一致,其采用Lipozyme RM IM催化紫苏籽油和甘油酯化合成制备甘二酯过程中发现反应温度和底物摩尔比都对甘二酯的得率有影响。当温度升高到最适温度以上时,虽然较高的温度加快了反应速度,但是酶结构受到破坏,部分酶失去活性,不能继续催化反应的进行,造成反应的酯化度降低。

2.6 反应条件优化及模型验证

利用Design expert 8软件对酶催化油酸和甘油合成甘三酯的最佳反应条件进行预测,得到最佳的反应条件为:底物摩尔比2.92∶1,反应时间为12 h,反应温度98.34 ℃,加酶量为2.96%。考虑到实际操作的局限性,将工艺参数中的反应温度调整为98 ℃。在此优化条件下进行3次平行验证实验,得到甘三酯平均含量为90.88%±1.56%,酯化度平均为93.09%±1.42%,软件模型预测值分别为94.50%和96.01%,实验结果与预测值相近,说明该响应面模型预测是有效的。

3 结论

通过响应面实验优化分析,得出4个因素对甘三酯含量大小的顺序为:摩尔比>反应温度>加酶量>反应时间。脂肪酶Novozym 435促油酸甘油酯化制备甘三酯的最佳反应条件为:底物摩尔比(油酸:甘油)2.92∶1,反应时间12 h,反应温度98 ℃,加酶量(以油酸和甘油总质量计)2.96%。在最优条件下,得到甘三酯含量为90.88%±1.56%,酯化度为93.09%±1.42%。根据该工艺的反应特点,甘油可与高酸价油脂中的游离脂肪酸进行酯化反应,降低油脂酸价,增加甘三酯的含量,预测该酯化反应亦可用于高酸价油脂的脱酸工艺。

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Optimization of enzymatic esterification of oleic acid with glycerol for the preparation of triglycerides by response surface methodology

XU Guang-wei,BI Yan-lan*,LIU Tai-yu

(College of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

The triglycerides were synthesized from glycerol and oleic by Novozym 435 lipase catalysis in a solvent-free system,and the reaction conditions were optimized by response surface methodology(RSM). The substrate molar ratio,reaction time,reaction temperature and enzyme load strongly affected triglyceride content(p<0.05),and substrate molar ratio had the most significant effect on triglyceride content(p=0.0104). The optimum conditions were as follows:substrate molar ratio(oleic acid/glycerol)2.92∶1,reaction time 12 h,reaction temperature 98 ℃,and enzyme load 2.96%(based on the total weight of oleic acid and glycerol). Under the optimum conditions,triglyceride content was 90.88%±1.56%,esterification degree was 93.09%±1.42%.

Novozym 435;response surface methodology;esterification;glyceroltrioleate

2014-12-11

徐广维(1990-)，男，硕士研究生，研究方向：油脂化学，E-mail：xuguangwei100@163.com。

*通讯作者:毕艳兰(1969-)，女，硕士，教授，研究方向：油脂化学及油脂检测，E-mail：bylzry@126.com。

现代农业产业技术体系项目(CARS15-1-10)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)21-0259-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.045