多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展

李 凡,许恒毅,李福来

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展

李 凡,许恒毅*,李福来

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

食源性致病菌的多重PCR检测技术是指能够同时扩增得到同种或多种致病菌的不同基因片段的技术。因该技术特异、灵敏且分析效率高,现已被广泛应用于食源性致病菌的检测工作中。本文介绍了多重PCR在食源性致病菌检测中应用的研究近况,并对影响因素及存在的问题进行了阐述。

多重PCR,食源性致病菌,快速检测,研究进展

近年来,国内外食品安全事件频发,食源性疾病的爆发率一直居高不下,给人们带来了巨大的损失和伤害,且引起了各国政府的广泛关注。据报道,发达国家每年因不安全食品导致的患病人数比例高达30%,仅美国每年有7600万人身患食源性疾病,约有5200人死亡[1]。而我国食源性疾病监测网地区在2001～2010年统计到全国各地食源性疾病暴发事件共5021起,累计发病140101人(含死亡1427人),死亡率为1.019%,其中由食源性致病菌引起的死亡占40.93%[2]。因此,快速检测和鉴别食源性致病菌是有效预防和控制食源性疾病的关键环节。

目前,用于食源性致病菌检测的方法主要有传统培养法、免疫学方法和分子生物学方法三类[3],传统培养法检测过程繁琐、耗时且工作量大,无法满足快速检测的需要;免疫学方法由于方法本身的局限性,易发生交叉反应且存在一定程度的漏检;分子生物学方法因其操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高等特点,已被广泛应用于食源性致病菌的检测。其中,最常见用于食源性致病菌检测的分子生物学方法是PCR技术,但常规PCR方法一次实验只能检测一种病原菌,而食品样品中往往涉及不同种类和型别的细菌。多重PCR(mPCR)技术不仅兼具普通PCR技术的优势,还可快速地一次性检测多种食源性致病菌,提高检测效率和准确性。本文对多重PCR技术在食源性致病菌检测中应用的研究进展进行了综述,旨在为基于多重PCR方法检测食源性致病菌的研究和建立方法提供参考。

1 多重PCR的原理

多重PCR是指在同一反应体系中加入两对或两对以上特异性引物扩增出多个目的片段的方法。其原理如图1所示,在模板DNA、dNTP、适当缓冲液以及特异性引物存在下,依赖于DNA聚合酶的催化,使多对特异性引物所界定的DNA片段进行扩增。由于多重PCR可在同一个反应体系中同时检测多个基因,节约了检测时间和成本,是一种既高效又经济的食源性致病菌检测技术。

图1 多重PCR原理图Fig.1 The schematic diagram of multiplex PCR

2 多重PCR在食源性致病菌检测中应用的研究进展

在检测食源性致病菌时,多重PCR扩增的靶基因主要为16S rRNA、菌株相关的特异性基因、毒力相关基因等三类。用于食源性致病菌属间检测的靶基因一般为较保守的16S rRNA,用于食源性致病菌属内种间检测的靶基因一般为种特异性基因。应用多重PCR检测食源性致病菌的关键是根据靶基因合理地设计引物。

2.1 用于检测单一食源性致病菌

对于具有复杂血清型的致病菌如大肠杆菌和沙门氏菌,采用传统PCR方法检测特异性差,易造成错判。多重PCR方法相比普通PCR方法可以同时考察多个菌株特征,具有更高的特异性。O157∶H7是致病性大肠杆菌的主要血清型,Bai等[4]根据大肠杆菌O157∶H7的特异性基因fliC、stx1、stx2、eae、rfbE和hlyA建立多重PCR方法,对221株产志贺毒素大肠杆菌进行检测,结果所有大肠杆菌O157均特异性地扩增出6条片段,经过6 h富集培养后检测限达到10 CFU/g。Gordillo等[5]采用多重PCR方法同时检测大肠杆菌O157∶H7中编码O157抗原的rfbE和编码H7鞭毛抗原的fliCh7,设计了2对引物,在供试的14株参考菌株中,仅2株为阳性结果,其余均为阴性,有效地防止了错检,提高了结果的准确性。Lim等[6]选择鼠伤寒沙门氏菌中编码O4抗原的rfbJ、编码H:i抗原的fliC和编码H:1,2抗原的fljB为目的基因,设计了3对引物,应用多重PCR进行检测,在供试的32株已知菌株中,3株鼠伤寒沙门氏菌均扩增出663、183和526bp的3条片段,表现出较高的特异性。Trafny等[7]根据沙门氏菌的hilA、spvA和invA,肠炎沙门氏菌的sdf以及16S rRNA设计了5对引物,应用多重PCR对粪便进行检测,可特异性地检出肠炎沙门氏菌。

对于具有较多毒力基因的致病菌如金黄色葡萄球菌,采用多重PCR方法对致病菌中多个毒力相关基因进行同时检测,不仅可以检出致病菌,还可了解致病菌含毒力相关基因的数量及致病性的强弱。Nagaraj等[8]根据金黄色葡萄球菌的5种毒力相关基因(sea、seb、sec、seg和sei)、TSST-1编码基因(tst)、甲氧西林耐药性基因(mecA)、以及凝固酶相关基因(coa)设计合适的引物,建立多重PCR方法,并设置内标以排除假阴性结果。在供试的91株金黄色葡萄球菌中,内标均为阳性,扩增出sea、seb、sec、seg、sei、tst、mecA以及coa的比率分别为36.26%、28.57%、61.53%、59.34%、58.24%、3.29%、27.47%、95.60%,结果证明绝大部分金黄色葡萄球菌携带两种或两种以上的毒力相关基因。Ertas等[9]采用多重PCR方法对150份甜点和干酪样品进行检测,先根据生化实验确定含有凝固酶阳性葡萄球菌(CPS)的样品,再根据CPS的sea、seb、sec和sed四种肠毒素相关基因设计引物,进而了解CPS中的四种肠毒素相关基因存在状况。

2.2 用于检测属内种间的食源性致病菌

对于同一属内的食源性致病菌,应用多重PCR方法进行检测不仅可提高结果的准确率,还可快速地一次性检测属内多种食源性致病菌,提高检测效率。Wei等[10]根据弧菌属的16S rRNA保守序列以及种特异性基因gyrB(溶藻弧菌)、collagenase(副溶血性弧菌)、vvhA(创伤弧菌)、ompW(霍乱弧菌)设计了五对引物,建立多重PCR方法,可同时检出上述4种致病菌,缩短了检测时间,大大地提高了检测效率。同时利用弧菌属16S rRNA序列极为保守稳定的特点将其作为内标进行属的鉴别,保证了检测结果的准确率。Ryu等[11]选择李斯特菌属的属特异性基因prs以及lmo1030(单核细胞增生李斯特氏菌)、Oxidoreductase(格氏李斯特氏菌)、lin0464(无害李斯特菌)、namA(伊氏李斯特菌)、scrA(威氏李斯特菌)、lmo0333(斯氏李斯特菌)设计了七对引物,应用多重PCR对肉制品中分离出的93株李斯特菌进行检测,结果发现有81株为单核细胞增生李斯特氏菌、10株为无害李斯特菌、2株为威氏李斯特菌。该方法利用李斯特菌属的prs作为内标,以指示检测中出现的假阴性,提高检测的准确率。同时可检测多种菌,与普通PCR方法相比,具有更高的检测效率。

对于培养条件较为严格的致病菌如弯曲杆菌属,多重PCR方法可弥补传统培养法难于操作的不足。Amri等[12]选择弯曲杆菌属的cadF以及hipO(耶尔森弯曲杆菌)、asp(大肠弯曲杆菌)建立多重PCR方法,灵敏度都达到15～16 ng DNA/mL,各反应体系组分间未发生任何交叉反应。而对74株弯曲杆菌属进行马尿酸盐水解验证实验,结果有17株菌表现为假阳性和7株菌表现为假阴性。

2.3 用于检测不同属的食源性致病菌

多重PCR可同时对不同属的食源性致病菌进行检测和分析,快速确定食品中是否存在某种致病菌,相对于上述两种检测,具有更高的检测效率和实际应用价值。大多数食源性致病菌1～10 CFU剂量即可致病,对于含目的菌数量少或者存在复杂干扰性成分的常规食品,直接用PCR方法检测灵敏度低且特异性差,一般前期需要对目的菌进行预增菌或高效分离富集。Chiang等[13]应用多重PCR方法同时检测牛奶和肉制品中的单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7等多种致病菌,直接检测其灵敏度为103～104CFU/mL,而在TSB中经过8 h富集培养后,其灵敏度可达1 CFU/mL。Lee等[14]报道了多重PCR方法在同一反应体系中检测大肠杆菌O157∶H7、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌的方法,在对食品的模拟检测中,细菌经过12 h的富集,灵敏度都达到1 CFU/mL,缩短了检测时间并节省了成本,有效地提高了检测效率。Guan等[15]根据invA(沙门氏菌)、nuc(金黄色葡萄球菌)、hlyA(单核细胞增生李斯特氏菌)、ail(小肠结肠炎耶尔森氏菌)和rfbE(大肠杆菌O157∶H7)设计了5对引物,建立多重PCR方法,在猪肉模拟检测中,经过夜富集培养后,可同时检测出上述5种菌,检测限都达到103CFU/mL。Garrido等[16]采用多重荧光定量PCR方法检测食品中的沙门氏菌和单增李斯特菌,用改良过的TA10选择培养基进行富集培养,检测限都达5 CFU/25g。为了缩短检测时间,同时清除食品基质中的干扰物,Ma等[17]将多重荧光定量PCR方法与免疫磁分离技术结合,检测鲜肉制品中的沙门氏菌、志贺氏杆菌及金黄色葡萄球菌,能将灵敏度降至沙门氏菌2.0 CFU/g、志贺氏杆菌6.8 CFU/g、金黄色葡萄球菌9.6 CFU/g,有效地避免了实际样品中相关致病菌的漏检。同时该方法简化了样品富集步骤,缩短了检测时间(≤8 h),大大提高了检测效率。

此外,将多重PCR与其他技术结合在同时检测不同属的食源性致病菌中也有不少应用。Chiang等[18]结合多重PCR方法和基因芯片技术,检测牛奶和肉制品中的单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、无乳链球菌、副溶血性弧菌和荧光假单胞菌共8种致病菌,直接检测灵敏度为103～104CFU/mL,在TSB中经过8 h富集,灵敏度达到1 CFU/mL。Morin等[19]根据rfbE和fliC(大肠杆菌O157∶H7)、rfbE(霍乱弧菌)及tyv(伤寒沙门氏菌)设计了四对引物,建立多重反转录PCR方法,提取致病菌的mRNA,将其反转录成cDNAs后再进行PCR扩增,可同时检测上述三种致病菌。由于mRNA只存在于活细菌中,避免了死菌中DNA对PCR扩增的干扰。Yang等[20]对食品中的鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7和单核细胞增生李斯特氏菌进行检测时,用免疫磁珠捕获目的菌后,采用叠氮溴化丙锭(PMA)对目的菌进行处理,由于PMA完全不能通透细胞膜,只能选择性的修饰死菌“暴露”的DNA(细胞壁和细胞膜已破损的细菌),形成共价氮碳键,抑制死菌DNA在PCR时的扩增,提高了多重PCR检测活菌的准确率。同时该方法不需要经过富集处理,整个检测过程仅需4.5 h,且灵敏度高,有效地提高了检测效率。

3 影响多重PCR的因素

多重PCR在同一反应体系中对多个DNA片段进行特异性扩增,反应体系较为复杂,影响扩增效果的因素较多,大体可分为反应体系和反应条件两大类。其中,反应体系主要包括引物、TaqDNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反应条件主要包括退火温度和循环数等[21]。引物设计则是实验成败的关键,直接影响多重PCR的特异性和灵敏度。引物设计不当各引物间极易形成引物二聚体或产生非特异性扩增产物[22],不仅消耗反应体系中的各组分,而且还影响退火与延伸的速率。引物设计时应特别注意目标序列的同源性引物、长度、GC含量、浓度等因素,还应注意各引物对间的最适退火温度尽可能相同且无任何交互作用等。TaqDNA聚合酶用于催化反应,由于多重PCR中存在多个DNA片段的扩增反应,各反应间会不同程度地竞争TaqDNA聚合酶,若TaqDNA聚合酶使用量过低会抑制竞争效率低的DNA扩增,过多则会导致非特异性扩增[23]。dNTP和MgCl2二者具有相关性,在反应体系中两者应保持平衡。退火温度取决于引物的长度、碱基的组成和目的片段的长度,决定反应的特异性与产量。在实验过程中,应综合考虑各个解链温度(Tm),在Tm值允许范围内,选择较高的退火温度以减少引物和模板间的非特异性结合,确保PCR反应的特异性[24]。循环数取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的速率,一般含105个拷贝的靶序列的反应体系在TaqDNA聚合酶的催化下进行30个循环就能够有效地扩增目的片段。

4 结语

多重PCR具有高特异性、高灵敏度、高效率和低成本等优点,目前已广泛应用于食源性致病菌的检测。但在实际应用中还应特别注意以下问题:1)食品中存在的复杂抑制因子干扰PCR扩增;2)较易形成引物二聚体和非特异性扩增;3)较难区别活菌和死菌。因此,未来的研究主要集中在对样品前处理技术进行改进,去除抑制因子的干扰,同时不断优化多重PCR的反应体系和反应条件,并与其他技术结合如多重逆转录PCR[19,25]、多重荧光定量PCR[16,26]、多重PCR基因芯片技术[18,27]等,以及加入核酸交联剂如叠氮溴化丙锭(PMA)、叠氮溴化乙锭(EMA)等抑制死菌DNA的扩增用于区别活菌和死菌[28],提高反应的灵敏度和特异性。随着分子生物学检测理论和技术的不断发展与完善,多重PCR必将在检测食源性致病菌方面具有更好的应用前景。

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Application of multiplex polymerase chain reaction in detection of foodborne pathogens

LI Fan,XU Heng-yi*,LI Fu-lai

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Multiplex polymerase chain reaction(mPCR)for detection of foodborne pathogens is a kind of detection technique which can simultaneously amplify multiple gene fragments of the one pathogen or different pathogens. Due to these advantages of high specificity,sensitivity and efficiency,mPCR is widely used for the detection of foodborne pathogens. In this article,the applications of mPCR in the detection of foodborne pathogens during the past 10 years are reviewed,and the influence factors or problems of mPCR are discussed.

multiplex polymerase chain reaction;foodborne pathogen;detection;research progress

2015-01-12

李凡(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全与检测，E-mail：349465359@qq.com。

*通讯作者:许恒毅(1981-)，男，博士，副研究员，研究方向：食品生物技术，E-mail：kidyxu@163.com。

江西省青年科学家(井冈之星)培养对象项目(20142BCB23004)；“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAK10B06)。

TS207.4

A

1002-0306(2015)21-0372-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.069