葡聚糖凝胶在FD—1—1项目中的应用

陈辅辰

摘 要：本文通过对比几种常见凝胶的理化性质，详细介绍了葡聚糖凝胶的筛选及在FD-1-1项目中的应用。

关键词：葡聚糖凝胶；分配系数；凝胶处理；装柱；上样；洗脱

凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种，凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当蛋白质分子通过装有凝胶颗粒的色谱柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。

1 葡聚糖凝胶技术的原理

凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。

2 葡聚糖凝胶（Sephadex）的种类和性质

凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。

SephadexG ：G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。根据不同的吸水值主要有：Sephadex G-1O、Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、SephadexG-150、Sephadex G-200。

3 分配系数（Kd）：Ve=Vo+Kd·Vi

每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数。

Vo简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。

Vi简称内水体积，可由g.Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL/g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示： Ve=Vo+Kd·Vi。式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。

当Kd=0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子 =Vo+0.8Vi；当0

4 葡聚糖凝胶的应用

4.1 装柱

一般选用细长的拄作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。 一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。

新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。

新装好的柱要检验其均匀性-可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。

4.2 加样

由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降。一般要求样品粘度小于0.01Pa.s（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4%为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品1～2mL，制备用量一般为每100mL床体积加样品20～30mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。

（1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度11.8；（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2；（3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%。

样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。样品上柱是凝胶层析中最关键的一步。理想的样品色带应是狭窄且平直的巨型色谱带。为了做到这一点，应尽量减少加样时样品的稀释以及样品的非平流流经凝胶层析床体。反之将造成色谱带扩散、紊乱，严重影响分离效果。加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。这一点在分级分离时尤为重要，应严格按一定的操作程序进行，通常有下列三种方法：（1）.直接将样品加到层析床表面。（2）.利用两种液体比重不同而分层的原理，将高比重样品加入床表面低比重的洗脱液之中，样品就慢慢均匀地下沉于床表面，再打開出口，使样品渗入层析。（3）.可用微量泵控制。

4.3 洗脱

为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜过快且要稳定。冼脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。在许多情况下可以用水作洗脱剂，但为了防止非特异吸附，避免一些蛋白质在纯水中难以溶解（析出沉淀），以及蛋白质稳定性等问题的发生，常采用缓冲盐溶液进行洗脱。离子浓度至少0.02mol/L方可获得较好的结果，因为凝胶含有少量羧基，会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用盐等介质应比较容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸铵等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物进行洗脱。

4.4 凝胶的再生和保养

在洗脱过程中，所有组分一般都可被洗脱下来，所以装好柱后，可反复使用，无需特殊的再生处理。但多次使用后，凝胶颗粒可能逐渐沉积压紧，流速变慢。这时只需将凝胶自柱内倒出，重新填装。或使用反冲法，使凝胶松散冲起，然后自然沉降，形成新的柱床，这样流速会有所改善。葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。

为防止细菌生长和发酵，可用0.02%叠氮化钠、0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）或0.002%洗必泰、0.01%醋酸苯汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂）以及0.1mol/L氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析前再用水或平衡液将防腐剂洗去。凝胶用过后，有几种保存方法：⑴湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；⑵半收缩保存：水洗后滤干，加70%乙醇使胶收缩，再浸泡于70%乙醇中保存；⑶干燥保存：水洗后滤干，依次用50%、70%、90%、95%乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥（或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。

5 葡聚糖凝胶技术在FD-1-1项目中的应用

由于FD-1-1项目批产量比较小，葡聚糖凝胶技术具有操作条件温和，样品回收率可接近100%，并且重复性高；作为脱盐手段，与透析法相比速度快、精度高；与超滤法相比，蛋白活性收率高；分离机理简单，操作参数少，容易规模放大等特点，在FD-1-1项目中得到了广泛应用。

在N2-N1的反应中，利用葡聚糖凝胶技术除去了样品中小分子的杂质。在成品的纯化中，由于制备液相流动相是盐溶液，在除盐过程中也用到了葡聚糖凝胶技术。由于FD-1-1项目批产量比较小，葡聚糖凝胶技术具有操作条件温和，样品回收率可接近100%，并且重复性高，因此葡聚糖凝胶技术在FD-1-1項目中得到了广泛应用。

参考文献

[1] C.J. Jones， C.K. Larive， Cracking the proteoglycan code， Nat. Chem. Biol. 7 （2011）758–759.