UPLC法同时测定痺苓祛痛颗粒中常春藤皂苷元和齐墩果酸含量

李 瑛 吴小明 汪永忠 段贤春 魏良兵 吴 健 韩燕全

UPLC法同时测定痺苓祛痛颗粒中常春藤皂苷元和齐墩果酸含量

李 瑛 吴小明 汪永忠 段贤春 魏良兵 吴 健 韩燕全

目的 建立UPLC法同时测定痺苓祛痛颗粒中常春藤皂苷元和齐墩果酸含量的方法。方法Acquity BEH C18(2.10 mm×100 mm，1.70 μm)为色谱柱，流动相乙腈-水(90 ∶10)，0.20 mL/min流速，30℃柱温，205 nm波长为条件。结果常春藤皂苷元和齐墩果酸的进样量在0.093 2～0.932 0 μg(r=0.9995)、0.301 5～3.015 0 μg(r=0.999 4)范围内与其峰曲线下面积分别呈良好的线性关系；两者平均回收率分别为96.28%和98.62%，RSD为2.53%和1.70%。结论建立的含量测定方法简单、准确、快速，可用于痺苓祛痛颗粒的质量控制。

痺苓祛痛颗粒；常春藤皂苷元；齐墩果酸；超高效液相色谱；含量测定

痺苓祛痛颗粒为国家中医临床研究基地(研究病种：糖尿病)特色中药制剂，处方由威灵仙、当归、黄柏、萆薢等十味药组成，具有清热解毒，祛湿泻浊，活血通络之功效。临床应用多年，对于痛风急性期、间歇期和类风湿性关节炎红肿痛患者效果良好[1]。本文采用UPLC法对痺苓祛痛颗粒的有效成分(常春藤皂苷元和齐墩果酸)含量进行测定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；KQ3200DB型超声仪(江苏昆山超声仪器有限公司)；电子天平(德国赛多利斯 BP211D)。

痺苓祛痛颗粒由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供，批号：20130226、20131012、20140307；常春藤皂苷元(含量测定用，批号：1117333-200904)、齐墩果酸(含量测定用，批号：110709-200505)、对照品购自中国药品生物制品检定研究院；液相用试剂为色谱纯(美国TEDIA公司)，其它所用试剂均为分析纯；蒸馏水(屈臣氏)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Acquity BEH C18(2.10 mm×100 mm,1.70 μm) 色谱柱，柱温：30℃；以乙腈-水(90 ∶10)为流动相；流速0.20 mL/min， 205 nm检测。

1.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取常春藤皂苷元和齐墩果酸对照品，置容量瓶中，加入适量CH3OH超声溶解，冷却，再用CH3OH补充至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.186 4 mg/mL、0.603 0 mg/mL混合对照品溶液，备用。

1.2.3 供试品溶液的制备[1]精密称定制剂粉末4.0 g滤纸包裹，加乙酸乙酯适量，索式回流提取3 h，弃去提取液，残渣挥干溶剂，与滤纸筒一起转移至烧瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称重，加热回流1 h，取出，放冷后再称重、补重，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，水浴蒸干，残渣加2.0 mol/L的HCl溶液30 mL使溶解，转移至锥形瓶中水浴加热回流2 h，取出，冷却，转移至分液漏斗中。少量水洗涤容器，洗涤液合并转移入分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加CH3OH溶解，转移至10 mL容量瓶中，加CH3OH至刻度，摇匀，即为供试品溶液。

另按痺苓祛痛颗粒处方比例制备不含威灵仙药材的样品，同法制备阴性对照溶液。

2 结果

2.1 专属性考察 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各1.0 μL，进样测定，结果显示对照品溶液与供试品溶液在相同的保留时间有对应的色谱峰，而阴性对照溶液在对应的保留时间无色谱峰，表明本法的专属性良好。见图1～图3。

2.2 线性关系考察 吸取配好备用，按梯度逐步稀释成6个浓度的混合对照品溶液，进样量1.0 μL逐个进样，按“2.1”色谱条件测定，记录AUC。以对照品进样量为横坐标，AUC为纵坐标，绘制标准曲线，常春藤皂苷元标准曲线为Y=5 301 271.591 5X+10 863.186 3(r=0.999 5，n=6)，齐墩果酸的标准曲线为Y=22 663 57.336 6X+18 503.3589 (r=0.999 4，n=6)。常春藤皂苷元和齐墩果酸的进样量分别在0.093 2～ 0.932 0 μg、0.301 5～3.015 0 μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液1.0 μL，照上述色谱条件重复6次进样测定，记录峰面积。结果显示常春藤皂苷元和齐墩果酸的RSD分别为0.62%和0.48%(n=6)，表明精密度良好。

2.4 稳定性试验 取20140307批供试品溶液于室温下放置，分别于0、2、4、8、16、24 h按“1.2.1”色谱条件进样1.0 μL测定，记录AUC。结果显示常春藤皂苷元和齐墩果酸的RSD分别为0.61%和1.08%(n=6)，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.5 重复性试验 取20140307批次制剂样品4.0 g，按1.2.3项下制备方法平行制备6份供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件进样1.0 μL测定，记录AUC。结果显示常春藤皂苷元和齐墩果酸的RSD分别为0.98%和1.48%(n=6)，表明本法重复性良好。

2.6 加样回收率试验 取20140307批已知含量的制剂样品适量6份，精密称定，分别精密加入适量常春藤皂苷元和齐墩果酸对照品溶液，按“1.2.3”制备方法制备供试品溶液，照“1.2.1”色谱条件进样测定，记录AUC，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

2.7 样品含量测定 取上述3个批次的制剂样品各4.0 g，按“1.2.3”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件各进样1.0 μL测定，记录AUC，代入标准曲线计算样品中常春藤皂苷元和齐墩果酸的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(mg/g)

3 讨论

威灵仙古时就为治疗痹证的常用方药，对于痹证的治疗效果良好。本文采用UPLC法对痺苓祛痛颗粒君药威灵仙中的有效成分常春藤皂苷元和齐墩果酸同时进行了含量测定[2,3]，同时测定的方法可以对样品中的两个及以上的指标成分进行同步分析，可以减少分析的时间及溶剂的损耗[4]。另外本文采用的UPLC法较普通HPLC法更具有灵敏度高、分离度高、分析时间短和进样量少等特点[5]，两者一起大大提高了制剂分析的效率，是对于中药制剂的复杂成分特别适用，可以在中药分析中广泛应用[6]。

由于本实验供试品溶液提取方法较为复杂，实验中分别比较了不同浓度的乙醇超声及水浴回流提取方法，结果发现与索式提取除杂相比，其他方法中的杂质峰干扰均较明显，杂质成分较多，因此本实验仍采用了2010年版《中国药典》威灵仙项下的方法处理样品。

实验结果表明，本研究建立的同时含量测定方法可行，具有较高分离度和专属性，可作为痺苓祛痛颗粒的质量控制方法之一。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010:234.

[2] 郝宁,于艳,张漫霞,等.威灵仙总皂苷和总黄酮超声提取工艺[J].中药材,2014,37(5):884-889.

[3] 郭宇姝,窦冕,张沂,等.HPLC-ELSD测定咽炎颗粒中齐墩果酸与常春藤皂苷元[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(2):51-54.

[4] 李璐,林文华,严萍,等.不同来源威灵仙常春藤皂苷元和齐墩果酸的含量测定[J].安徽农业科学,2013,41(7):2910-2911.

[5] 吴健,吴小明,高家荣,等.UPLC同时测定复方守宫散中蒽醌类含量[J].辽宁中医药大学学报,2014,16(6):60-62.

[6] 汪永忠,姜蕾,韩燕全,等.超高效液相色谱法同时测定丹蛭降糖胶囊中丹皮酚和芍药苷含量[J].中国新药杂志,2012,21(12):1337-1340.

(2014-11-01 收稿 2014-12-22 修回)

Simultaneous determination of ivy sapogenin and oleanolic acid contents in Biling qutong powder by UPLC

LiYing,WuXiaoming,WangYongzhong,etal

AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230032,China

Objective To establish a UPLC method for the determination of ivy sapogenin and oleanolic acid in Biling qutong powder. Methods The determination was performed on Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.70 μm) with mobile phase consisted of Acetonitrile-water (90 ∶10)at a flow rate of 0.20 mL/min. Column temperature was 30 ℃.The UV detection wavelength was set at 205 nm. Results The calibration curves were linear in the range of 0.0932～0.9320μg(r=0.999 5) for Ivy sapogenin, 0.301 5～3.015 0 μg(r=0.999 4)for oleanolic acid. The average recovery was 96.28% and 98.62% respectively, and the RSD was 2.53% and 1.70% respectively. Conclusion The determination method is simple, accurate and fast, which can be used for quality control of Biling qutong powder.

Biling qutong powder; Ivy sapogenin; Oleanolic acid; UPLC; Content determination

安徽中医药大学临床科学研究基金项目(项目编号：2012LC1-016B)

230032 合肥 安徽中医药大学(李瑛,汪永忠) 230031 合肥 安徽中医药大学第一附属医院(李瑛,吴小明,汪永忠,段贤春,魏良兵,吴健,韩燕全)

汪永忠, wyzhmail@163.com

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.03.003