不同培养基及不同温度对体外培养泡球蚴原头节的影响

赵阶峰，夏海洋，郁晓峰，张示杰，彭心宇，杨宏强

不同培养基及不同温度对体外培养泡球蚴原头节的影响

赵阶峰，夏海洋，郁晓峰，张示杰，彭心宇，杨宏强

目的 观察不同温度下不同培养基对体外培养泡球蚴原头节的影响，探讨泡球蚴原头节体外培养合适条件。方法 按照培养基的不同，随机分为3组：Ⅰ组为含10%胎牛血清的RPMI-1640(4 ℃、25 ℃、37 ℃)；Ⅱ组为含10%胎牛血清的D-MEM(4 ℃、25 ℃、37 ℃)；Ⅲ组为含10%胎牛血清的M199(4 ℃、25 ℃、37 ℃)。观察各组泡球蚴原头节存活、生长情况，并记录原头节存活率及最长生存时间。结果 RPMI-1640培养基、D-MEM培养基与M199培养基中泡球蚴原头节的存活率有统计学差异(P<0.05)，RPMI-1640培养基与D-MEM培养基中泡球蚴原头节的存活率无统计学差异(P>0.05)；4 ℃、25 ℃与37 ℃泡球蚴原头节的存活率无统计学差异(P>0.05)，但RPMI-1640培养基在4 ℃及37 ℃，D-MEM 培养基在25 ℃泡球蚴原头节存活率较高；各组在第3 d和第9 d泡球蚴原头节存活率有统计学差异(P<0.05)。4 ℃各组原头节存活时间明显高于25 ℃组和37 ℃组。结论 不同温度及不同培养基对体外培养泡球蚴原头节的存活的影响不同，RPMI-1640在4 ℃下培养，D-MEM在25 ℃培养，原头节成活率较高，存活时间较长，M199培养基不适合泡球蚴原头节的体外培养。

泡状棘球蚴；原头节；温度；体外培养

泡状棘球蚴病是由泡状棘球蚴寄生在人体引起的致死性寄生虫病。该病酷似恶性肿瘤，可以随淋巴或血液等转移，引起肺、脑等脏器继发性感染[1-2]，因此有恶性包虫病(malignant echinococcosis)或“虫癌”之称，确诊后10年内的病死率高达94%[3]。国内外为了能够在实验室研究泡球蚴感染宿主的致病机理，寻找预防和治疗泡球蚴病的有效方法，通过大量的尝试相继建立了泡球蚴的继发感染动物模型[4-5]和泡球蚴体外培养模型[6]。体外培养模型与动物模型相比具有生长周期短，便于控制条件等优点，更重要的是体外培养对泡球蚴的生长发育等研究可以不受宿主的影响。

泡球蚴的体外培养与培养基及培养温度等有紧密的联系，目前国内外对泡球蚴原头节的体外培养多在37 ℃下进行，国外有学者[7]研究了细粒棘球蚴原头节在不同温度下不同培养液中的生存时间，而对于不同温度下不同培养基对泡球蚴原头节影响的实验却未见报道。本实验通过观察不同温度及不同培养基对泡球蚴原头节存活率及存活时间的影响，初步探索了泡球蚴原头节体外培养较合适的培养基及培养温度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及仪器 腹腔感染泡球蚴的灰仓鼠(购自新疆自治区疾病控制中心)，显微镜/采图系统(OLYMPUS公司)，二氧化碳培养箱(NUAIRE公司)。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清(HCLONE公司)，RPMI-1640、DMEM、M199培养基(GIBCO公司)，青霉素、链霉素(南京生兴生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 收集泡球蚴原头节 对感染泡球蚴的灰仓鼠施行安乐死，鼠体用碘伏及75%酒精进行表面消毒，无菌条件下从腹腔中取出泡球蚴组织并对其修剪，将宿主组织剥离干净后，PBS缓冲液(0.01 mmol/L，pH7.4)反复冲洗至液体澄清，用0.5 mm筛网研磨过筛泡球蚴囊泡组织及囊液，用含双抗的PBS液冲洗3遍后自然沉淀，收集泡球蚴原头节。将泡球蚴悬液定量稀释后，取10 μL均匀的混悬液伊红染色，观察活力并计数。

1.2.2 实验分组 收集原头节，根据培养基不同随机分为3组，每组在3种不同温度条件下培养：RPMI-1640组(4 ℃、25℃、37 ℃)，D-MEM组(4 ℃、25 ℃、37 ℃)，M199组(4 ℃、25 ℃、37 ℃)。每个培养瓶中平均培养5 000枚泡球蚴原头节。

1.2.3 泡球蚴原头节存活率的估算 每组等量取1滴原头节培养液，用0.1%伊红染色，在带有显微测微尺的倒置显微镜下观察。判断标准：死亡原头节红染着色，伴有结构破坏且无活动性；活头节不着色且有活动性。计数每100个原头节中着色数目，以不着色者占观察原头节的比例为其存活率，共计数300个计算平均存活率；观察并记录各组泡球蚴原头节存活天数。

1.3 统计学分析 泡球蚴原头节的存活率采用多因素方差分析法，在组内和组间进行两两比较；按α=0.05为水准，以P<0.05为有统计学差异，采用SPSS17.0软件分析处理。

2 结 果

2.1 各组泡球蚴原头节的存活率 统计学分析表明，RPMI-1640培养基组、D-MEM培养基组与M199培养基组泡球蚴原头节的存活率有统计学差异(P<0.05)，RPMI-1640培养基组与D-MEM培养基组泡球蚴原头节的存活率无统计学差异(P>0.05)；4 ℃、25 ℃与37 ℃各组泡球蚴原头节的存活率无统计学差异(P>0.05)，但RPMI-1640培养基组在4 ℃及37 ℃，D-MEM 培养基组在25 ℃泡球蚴原头节存活率较高；各组在第3 d和第9 d泡球蚴原头节存活率有统计学差异(P<0.05)(表1)。

表1 泡球蚴原头节的存活率

2.2 泡球蚴原头节的平均存活天数 3种培养基不同温度条件下，泡球蚴原头节的最长平均存活天数是：31 d(RPMI-1640，4 ℃)，36 d(D-MEM，25 ℃)，23 d(M199，4 ℃)。3组比较，M199最不适合泡球蚴原头节的培养，根据培养温度不同，可以选择D-MEM或者RPMI-1640培养基体外培养泡球蚴原头节(图1)。

图1 平均存活天数与培养基及温度的关系

3 讨 论

泡球蚴的体外培养是在体外模拟泡球蚴宿主体内生长环境，从而使泡球蚴在离开宿主的状态下完成生活史的部分或全部生长发育阶段，目前是评估抗泡球蚴药物疗效[8-9],分析和研究泡球蚴及其原头节的特异成分以及生长发育过程等的最佳途径。保持泡球蚴原头节较高的存活率以及最长存活时间是建立其有效体外培养的基础，其中培养基及培养温度是两个最主要因素，而现有的文献中未见不同培养基及不同温度对泡球蚴原头节的生存情况的研究。

本实验采用RPMI-1640、D-MEM和M199共3种培养基分别在4 ℃、25 ℃和37 ℃ 3个温度条件下培养泡球蚴原头节，观察泡球蚴原头节存活率以及存活时间，发现4 ℃及37 ℃下 RPMI-1640培养基中泡球蚴原头节的存活率及其存活时间高于D-MEM培养基和M199培养基；25 ℃下D-MEM培养基中泡球蚴原头节的存活率及其存活时间高于同温度下RPMI-1640培养基和M199培养基，这说明在相同温度下采用不同的培养基对体外培养泡球蚴原头节生存状况的影响是不同的，体外培养泡球蚴选用的培养基与培养温度存在相关性。

Ali Ihsan Diker等[10]研究发现，体外培养细粒棘球蚴原头节最长生存时间分别为：-10 ℃ 3 d，0 ℃ 36 d，10 ℃ 28 d，20 ℃ 12 d，30 ℃ 4 d，40 ℃ 3 d。Ahmed A. M. Al-Azzauy[7]对RPMI-1640、林格氏液及生理盐水3种培养液分别在4 ℃、25 ℃和37 ℃下细粒棘球蚴原头节的最长存活时间进行的研究发现，25 ℃下生理盐水中细粒棘球蚴原头节的存活时间最长。我们通过对比相同培养基在不同温度下泡球蚴原头节存活率及存活时间发现，RPMI-1640培养基在4 ℃下泡球蚴原头节的存活率及存活时间高于25 ℃与37 ℃，而D-MEM培养基在25 ℃下原头节存活率及存活时间高于4 ℃与37 ℃，这说明不同的温度对体外培养泡球蚴原头节存活情况影响不同。

综上所述，本实验通过在不同温度下不同培养基中培养泡球蚴原头节，发现与37 ℃的体外培养温度比较，4 ℃下的RPMI-1640培养基和25 ℃下的D-MEM培养基更能够提高泡球蚴原头节的存活时间，保证其较高的存活率，从而进一步拓宽泡球蚴体外培养的条件，对特异性表达的基因进行筛选和分离，确定该病有效治疗药物、疫苗候选基因以及进行基因靶向治疗奠定基础。

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Effects of different culture media onEchinococcusmultilocularisprotoscoleces at different temperaturesinvitro

ZHAO Jie-feng,XIA Hai-yang,YU Xiao-feng,ZHANG Shi-jie,PENG Xin-yu,YANG Hong-qiang

(HepatobiliarySurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China)

In order to observe the effects of different culture media and temperature on protoscoleces ofEchinococcusmultilocularis, they were randomly divided into RPMI-1640 group, D-MEM group and M199 group, and cultured in three degrees of temperature (4, 25 and 37 ℃) with 10% fetal calf serum (FCS). Protoscoleces were counted by light microscope with 0.1% eosin staining, and calculated survival rate (per 100 protoscoleces) everyday until all the parasites died. At the same time, the average number of the preservation days was observed. The experiment results showed that the survival rate of protoscoleces in RPMI-1640 and D-MEM groups were higher than that in M199 group (P<0.05) and there’s no significant difference between RPMI-1640 group and D-MEM group (P>0.05). The survival rate of protoscoleces in RPMI-1640 group at 4 ℃ and 37 ℃ and D-MEM group at 25 ℃ were higher, but there was no significant effect of 4, 25 and 37 ℃ on the survival rate of protoscoleces (P>0.05). Significant difference were found in the survival rate of protoscoleces on the 3rdday and the 9thday in these three groups (P<0.05). The average number of the preservation days were 34 days in RPMI-1640 group at 4 ℃, 36 days in D-MEM group at 25 ℃ and 23 days in M199 group at 4 ℃. It was concluded that the effects of different culture media and temperature on protoscoleces are different, and the RPMI-1640 at 4 ℃ and D-MEM at 25 ℃ are more suitable for culturing protoscolecesinvitro.

Echinococcusmultilocularis; protoscolece; temperature; culture media

Yang Hong-qiang, Email: hongq01@sina.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.012

国家自然科学基金项目(No.81160199)和兵团科技计划攻关项目(No.2014BA028)

杨宏强，Email:hongq01@sina.com

石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，石河子 832008

R383.3

A

1002-2694(2015)03-0244-03

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160199) and the Key Scientific and Technological Project of Construction Corps (No. 2014BA028)

2014-03-28；

2014-12-23