自然周期冻融胚胎移植的影响因素分析

张娟娟，李秀玲，王 培，张 娟，卢 莹，赵 纯，丁 卉，张军强，凌秀凤

(南京市妇幼保健院生殖医学中心，江苏 南京210004)

自然周期冻融胚胎移植的影响因素分析

张娟娟，李秀玲，王 培，张 娟，卢 莹，赵 纯，丁 卉，张军强，凌秀凤

(南京市妇幼保健院生殖医学中心，江苏 南京210004)

目的 探讨影响自然周期冻融胚胎移植临床妊娠成功的因素。方法 对南京市妇幼保健院生殖医学中心2011年1月至2013年12月行自然周期冻融胚胎移植治疗的282例患者的资料采用非条件Logistic回归分析法进行分析，并对回归分析的结果进行进一步的研究。结果 患者年龄、卵泡排出时间(其中的hCG注射后24小时内排卵组)、移植不同发育阶段胚胎与妊娠结局相关(偏回归系数分别为：-0.052，0.446，-0.081，均P<0.05)。不孕年限、移植胚胎数目、子宫内膜厚度与妊娠结局无显著关系(均P>0.05)。肌注绒毛膜促性腺激素(hCG)后24小时内卵泡排出者临床妊娠率高于未注射hCG组及48小时内卵泡排出者(χ2值分别为3.880和4.660，均P<0.05)。移植囊胚与卵裂期胚胎相比，具有更高的临床妊娠率。结论 年龄、卵泡排出时间、不同发育时期胚胎是影响自然周期冻融胚胎移植临床妊娠的重要因素。

自然周期；冻融胚胎移植；临床妊娠；Logistic回归

自1978年世界第1例试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)迅速发展，给成千上万的不孕不育患者带来了福音，其中冷冻技术的发展尤其是玻璃化冷冻技术的逐步成熟，为胚胎移植寻找合适的时机提供了强有力的保障。冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F-ET)常采用自然周期和人工周期两种不同的方案来准备内膜，其中自然周期F-ET具有激素水平接近生理状态、用药量少等优点。为提高自然周期F-ET临床妊娠率提供更多的理论依据，现对南京市妇幼保健院生殖医学中心2011年至2013共282例自然周期F-ET周期的资料行回顾性分析报告如下。

1 资料与方法

1.1 基本资料

选取2011年1月至2013年12月在南京市妇幼保健院生殖医学中心接受自然周期方案F-ET的患者282例，其中原发不育162例，继发不育120例。患者年龄21～45岁，平均年龄30.8±4.6岁；不育年限0.5～25年，平均不育年限3.7±2.8年；内膜厚度7～17mm(7mm以下取消移植)，平均内膜厚度10.0±1.8mm，内膜类型为A型或B型。根据患者的年龄、月经周期、优势卵泡的大小、既往B超监测排卵的结果决定是否肌注绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)以及注射hCG的时间；阴道B超监测排卵，根据卵泡排出时间的不同将患者分为未肌注hCG组、肌注hCG后24小时内卵泡排出组(24小时组)及48小时内卵泡排出组(48小时组)。常规肌注hCG后48小时仍不排卵者建议取消本次F-ET周期。根据患者的年龄以及剩余胚胎数目，移植胚胎数1～3枚。根据胚胎冷冻时胚胎发育阶段的不同，分为卵裂期胚胎(取卵后第3天)及囊胚(取卵后第5天及第6天)。

1.2 方法

1.2.1 自然周期冻融胚胎移植的纳入标准

①月经周期第2～3天基础内分泌检查正常；②平素月经规则；③既往曾进行自然周期卵泡监测证实有优势卵泡发育并排出。

1.2.2 黄体支持情况

排卵后当天开始行黄体支持，黄体酮每日40mg肌注，持续至移植后14天。

1.2.3 妊娠标准

术后第14天行血hCG测定，阳性为生化妊娠，继续行黄体支持，至术后4周，阴道B超检查发现妊娠囊确定为临床妊娠。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.1软件分析所有数据，多因素分析用Logisitc回归分析法。以妊娠结局为因变量(非妊娠=0，妊娠=1)，以可能影响临床妊娠成功的因素，如年龄、不孕年限、子宫内膜厚度、移植胚胎数、胚胎天数、排卵时间为自变量进行多因素Logisitc回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多因素Logistic回归分析情况

经多因素Logistic回归分析显示，年龄、卵泡排出时间(其中的hCG注射后24小时内排卵组)、移植不同发育阶段胚胎与妊娠结局呈显著相关(均P<0.05)；不孕年限、移植胚胎数目、子宫内膜厚度与妊娠结局无显著关系(均P>0.05)，见表1。

表1 影响自然周期F-ET临床妊娠因素的Logistic回归分析结果

Table 1 Logistic regression analysis of clinical pregnant factors affecting natural cycle F-ET

2.2 患者基本资料与临床妊娠情况

为进一步验证并分析Logistic回归分析的结果，按是否临床妊娠将患者分为临床妊娠组及未临床妊娠组，并对年龄、不孕年限、子宫内膜厚度及移植胚胎数目进行分析，两组的年龄比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

Table 2 Comparison of basic situations between clinical pregnant group and non-pregnant group

2.3 卵泡排出时间与临床妊娠

肌注hCG后48小时内卵泡仍未排出但患者夫妇坚持要求移植者仅3例，均未获临床妊娠，因样本量少未纳入以下统计。

未肌注hCG组共146个周期，临床妊娠率46.6%，低于肌注hCG后24小时组临床妊娠率59.8%，但高于肌注hCG后48小时临床妊娠率40.4%。24小时组与未用hCG组和48小时组比较均具有较高的临床妊娠率，差异均有统计学意义(χ2值分别为3.880和4.660，均P<0.05)，见表3。

表3 不同卵泡排出时间的临床妊娠结果比较[n(%)]

Table 3 Comparison of clinical pregnancy outcomes among cases with different timing of follicles discharge[n(%)]

2.4 不同发育阶段胚胎与临床妊娠情况

根据胚胎冷冻时胚胎发育阶段的不同分为卵裂期胚胎组及囊胚组，移植卵裂期胚胎101个周期，囊胚181个周期(其中移植第5天囊胚为172周期，移植第6天囊胚为9个周期)；卵裂期胚胎组临床妊娠率低于移植囊胚组(χ2=3.890，P<0.05)，见表4。

表4 不同胚胎发育阶段的临床妊娠结果比较[n(%)]

Table 4 Comparison of clinical pregnancy outcomes between embryos at different development stage [n(%)]

3 讨论

3.1 年龄对自然周期冻融胚胎移植临床妊娠的影响

本研究中通过Logist回归分析发现，自然周期F-ET的临床妊娠率与女性的年龄呈负相关。有研究证明，随着年龄的增长，卵子中过氧化物(如氧自由基等)的增加使卵子中线粒体数量明显减少，卵泡浆内三磷酸腺苷(ATP)的合成下降，ATP与谷胱甘肽/双巯基谷光甘肽(GSH/GSSH)比例下降，同时，细胞内钙离子浓度增加，增加了对处于第1次减数分裂静止期卵子的破坏作用，造成卵细胞染色体异常的几率增加，使卵子质量下降，从而使胚胎质量下降，降低了临床妊娠率[1]。

3.2 子宫内膜厚度对自然周期冻融胚胎移植临床妊娠的影响

子宫内膜容受性是决定妊娠成败的关键因素。有研究表明子宫内膜厚度<7mm时胚胎难以着床[2]。本研究中所有移植患者子宫内膜厚度均≥7mm，因而不存在内膜过薄而影响妊娠结局的病例。Logist回归分析结果显示，当子宫内膜厚度均≥7mm时，子宫内膜厚度与临床妊娠率无关，这与Binder等[3]对子宫内膜厚度与子宫内膜容受性无关的研究结果一致。另有Yaman等(2000年)对65例体外受精与胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的患者hCG注射日子宫内膜厚度与IVF-ET结局进行分析，认为hCG注射日的子宫内膜厚度不能预测妊娠的发生。

3.3 卵泡排出时间对自然周期冻融胚胎移植临床妊娠的影响

有报道显示，宫腔内人工授精(intrauterine inseminatio，IUI)术后24小时B超监测有排卵者妊娠率远远高于未排卵者的妊娠率[4]。本研究中发现，24小时组较48小时组有较高的临床妊娠率。众所周知，胚胎与子宫内膜的同步成熟是成功植入的必要条件[5]，对于F-ET来说，为胚胎寻找移植窗口期成为临床工作的目标。子宫内膜成熟是受母体卵巢类固醇激素雌二醇(E2)和孕酮(P4)的调控[6-7]。关于子宫内膜容受性的标志物，目前尚无定论，Nikas等(2000年)报道与胞饮突的存在有密切关系。亦有Acosta等(2000年)研究胞饮突的存在与内膜的移植窗口期并无直接关系。目前主要还是以子宫内膜组织学及显微电镜形态来评估子宫内膜的成熟情况。本研究中发现多数卵泡排出发生在hCG注射后的24小时内，并非既往研究中的卵泡破裂排卵发生在使用hCG后24～36小时。因此推测hCG注射后的24小时内排卵患者本身的黄体生成素(luteinizing hormone，LH)峰值在hCG发挥作用前已经形成，而非完全依靠hCG的作用；hCG注射后的48小时内排卵的患者依赖于hCG诱发的LH峰值，故而排卵延迟。由此推论，患者本身的LH峰值形成更有利于内膜的成熟及内膜种植窗的形成。

24小时排卵组较未用hCG组具有更高的临床妊娠率，因此推测可能与未用hCG组部分患者受地理条件限制未每日监测排卵，错失移植窗口期有关；另外，未用hCG组部分患者卵泡平均直径<15mm即已排出，其排卵期内分泌水平欠佳也是影响未用hCG组妊娠结局的可能原因之一。本资料受回顾性研究的限制，未能进一步研究及干预，提示若既往自然周期有优势排卵的患者，拟移植周期卵泡发育欠佳，可考虑取消移植或改行人工周期准备内膜。

3.4 移植不同发育阶段胚胎对自然周期冻融胚胎移植临床妊娠的影响

本研究中囊胚移植较卵裂期胚胎相比具有更高的临床妊娠率，但目前关于囊胚培养国内外均存在很多争议。ART的目的在于以最小的伤害、最低的经济支出获得最优的临床妊娠结局。胚胎质量无疑是影响胚胎移植临床妊娠最关键的因素之一。目前对胚胎质量的检测主要还是依靠形态学进行评分，但越来越多的研究表明，仅仅根据单一的形态学评分预测胚胎的发育潜力是不够精确的[8]。胚胎早期发育是极其复杂而精确的，随着发育的进展，胚胎呈现不同的生理特征。卵子成熟度、受精卵原核评级、胚胎形态评分或早期卵裂发生都与胚胎的发育潜能有一定的相关性[9]。胚胎基因组的激活始于8～10细胞期，多数发育潜能差、染色体异常的胚胎不能从该期发育到囊胚。卵裂期形态学评分低的胚胎经体外延长培养仍有部分能发育至囊胚，因此延长“非优质”胚胎体外培养时间，筛选出具有发育潜能的胚胎，可以最大限度地利用胚胎，尤其是无“优质胚胎”或者有“优质胚胎”但移植后未孕的患者。此外，自然生理状态下，早期胚胎在输卵管中发育，直到接近囊胚期才进入子宫腔。囊胚缩短了胚胎移植后进一步发育与着床之间的间隔，且子宫收缩减少，可减少胚胎排出体外[10]。与卵裂期胚胎相比，囊胚移植更符合自然生理现象，可提高临床妊娠率，因此认为囊胚培养有着重要的临床价值。

[1]Machtinger R, Bormann C L, Ginsburg E S,etal. Is the presence of a non-cleaved embryo on day 3 associated with poorer quality of the remaining embryos in the cohort?[J].J Assist Reprod Genet,2015,32(5):677-683.

[2] Xu B, Zhang Q, Hao J,etal. Two protocols to treat thin endometrium with granulocyte colony-stimulating factor during frozen embryo transfer cycles[J].Reprod Biomed Onli, 2015,30(4):349-358.

[3]Binder NK, Evans J, Hannan NJ,etal. Endometrial signals improve embryo outcome:Functional role of vascular endothelial growth factor isoforms on embryo development and implantation in mice[J].Hum Reprod,2014,29(10):2278-2286.

[4]Kucuk T.Intrauterine insemination:is the timing correct?[J].J Assist Reprod Genet,2008,25(8):427-430.

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[6]Wessels J M, Leyland N A, Foster W G,etal.Estrogen induced changes in uterine brain-derived neurotrophic factor and its receptors[J].Hum Reprod,2015,30(4):925-936.

[7]Choavaratana R, Thanaboonyawat I, Laokirkkiat P,etal.Outcomes of follicle-stimulating hormone priming and nonpriming in in vitro maturation of oocytes in infertile women with polycystic ovarian syndrome:A single-blinded randomized study[J].Gynecol Obstet Invest,2015,79(3):153-159.

[8]Assidi M, Montag M, Sirard M A. Use of both cumulus cells’ transcriptomic markers and zona pellucida birefringence to select developmentally competent oocytes in human assisted reproductive technologies[J]. BMC Genomics,2015,16 (Suppl 1):S9.

[9]Keefe D, Kumar M, Kalmbach K.Oocyte competency is the key to embryo potential[J].Fertil Steril,2015,103(2):317-322.

[10]Dupont C, Hafhouf E, Sermondade N,etal. Delivery rates after elective single cryopreserved embryo transfer related to embryo survival[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2015,188:6-11.

[专业责任编辑：吕淑兰]

Influential factors of clinical pregnancy outcomes of women receiving natural cycle frozen-thawed embryo transfer

ZHANG Juan-juan, LI Xiu-ling, WANG Pei, ZHANG Juan, LU Ying, ZHAO Chun, DING Hui, ZHANG Jun-qiang, LING Xiu-feng

(ReproductiveMedicalCenterofNanjingMaternalandChildHealthHospital,JiangsuNanjing210004,China)

Objective To investigate the influential factors of clinical pregnancy outcomes of women receiving natural cycle frozen-thawed embryo transfer. Methods Non-conditional Logistic regression analysis was conducted on the clinical data of 282 cases receiving natural cycle frozen-thawed embryo transfer during the period of January 2011 to December 2013 in Nanjing Maternal and Child Health Hospital. Results Patient’s age, ovulation (happened within 24 hours after hCG intramuscular injection) and embryo at different stage were correlated with pregnancy outcomes (partial regression coefficient was -0.052, 0.446 and -0.081, respectively, allP<0.05). Duration of infertility, endometrial thickness and the number of embryo transplantation had no relation with clinical pregnancy outcomes (allP>0.05). Cases whose ovulation happened within 24 hours after hCG intramuscular injection got higher clinical pregnancy rate than that of the cases without hCG injection and those whose follicles discharged within 48 hours after hCG injection (χ2value was 3.880 and 4.660, respectively, bothP<0.05). Besides, blastocysts were easier to grow compared with embryos at cleavage stage. Conclusion Age, the timing of ovulation and embryo at developmental stages are the key influential factors of natural cycle frozen-thawed embryo transfer.

natural cycle；frozen-thawed embryo transfer；clinical pregnancy；Logistic regression analysis

2014-10-08

张娟娟(1986-)，女，住院医师，硕士，主要从事生殖医学的研究。

凌秀凤，主任医师/副教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.036

R714.7

A

1673-5293(2015)03-0503-03