农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系研究

崔 波,刘 佳，王洁琼，蒋素华，武振江，叶永忠

(1.郑州师范学院，河南 郑州 450044； 2.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)



农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系研究

崔 波1,2,刘 佳2，王洁琼2，蒋素华1，武振江2，叶永忠2

(1.郑州师范学院，河南 郑州 450044； 2.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002)

以铁皮石斛原球茎为受体，研究了农杆菌介导的铁皮石斛遗传转化体系，对遗传转化中的草甘膦筛选压力，菌液浓度，乙酰丁香酮浓度，预处理方法，侵染时间，美罗培南浓度等转化影响因子进行了优化。结果表明，摁压处理下的原球茎在添加浓度为200 μmol·L-1乙酰丁香酮的菌液中侵染30 min, 菌液浓度OD600为1.0，共培养48 h后，转入添加质量浓度为50 mg·L-1美罗培南和质量浓度为2.0 mg·L-1的草甘膦筛选培养基中，转化效率最高。经GUS组织化学染色及PCR分析鉴定，初步证明ACC合成酶反义基因已整合到铁皮石斛的基因组中。

铁皮石斛；原球茎；ACC合成酶；遗传转化；转化体系优化

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)属兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)植物，有多方面的应用价值[1,2]。兰科快繁技术已较为成熟，在生产上得到广泛应用，但改良品种，开发新产品，满足人们对新、奇、特花卉种类的需求等尚有很多工作要做[3]。传统杂交育种是培育新品种的主要途径，但杂交育种受种质资源、生长缓慢、发育周期长[4,5]等因素的限制，而转基因技术可对铁皮石斛品种进行定向、快速改良植物的性状，是培育植物新品种的重要方法之一，也为兰科品种改良提供了广阔的前景[6]。兰科植物转基因研究起步较晚，目前尚处于初始阶段[7]。相对于传统的杂交育种手段，转基因技术具有目的性强，不受季节控制等诸多优点。其中根癌农杆菌介导的遗传转化是应用最广最成功的手段[8]，其高效植物转化系统转化方法不受基因型限制，便于操作，更利于获得稳定遗传的转基因植株。本研究以铁皮石斛的原球茎为试验材料，建立了铁皮石斛遗传转化系统，为铁皮石斛的分子育种研究打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料与菌株质粒 受体材料为铁皮石斛种子经无菌萌发产生的原球茎，农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为 EHA105(郑州师范学院生物工程研究所实验室保存)[9]，质粒为pCAMBIA3301-RTACS (含有ACC合成酶反义基因片段、GUS基因和PPT抗性基因，由本实验室构建)。

1.1.2 试剂与培养基 PPT(Glyphosate，草甘膦)，Mer(Meropenem，美罗培南)，AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)，Kana(Kanamycin,卡那霉素)，Rif(Rifampicin,利福平)，种子萌发培养基：1/4 MS+蛋白胨1 g·L-1+椰乳15%+KT 0.5 mg·L-1+糖15 g·L-1+AC 1 g·L-1+琼脂10 g·L-1；稀释培养基：1/2 MS液体培养基；共培养基：1/2 MS固体培养基；分化培养基：花宝1号3 g·L-1+1/2 MS +6-BA 10 mg·L-1+椰乳20 g·L-1+琼脂10 g·L-1+糖20 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 PPT压力筛选 将生长紧实、颜色浓绿的铁皮石斛原球茎进行PPT压力筛选，PPT质量浓度为0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，培养2个月并定期观察原球茎的生长状况。

1.2.2 受体材料的预处理 挑取生长期一致、优良的铁皮石斛原球茎25 ℃暗培养3 d后，进行刀切、摁压、针刺3种方式的预处理，使其产生伤口，利于农杆菌侵入原球茎组织内。

1.2.3 菌液活化 -80 ℃保存的带有pCAMBIA3301-RACS质粒的农杆菌，取出冰融，平板培养，随机挑选单菌落，接种到1 mL附加100 mg·L-1Kan和50 mg·L-1Rif的YEB液体培养基(pH值7.0)中，在恒温摇床上，28 ℃，220 r·min-1培养过夜，将菌液按1∶500的体积比转入50 mL新配制的含抗生素的YEB液体培养基中培养约16 h，测其 OD600为0.6、0.8、1.0、1.2，4 ℃下5 000 r·min-1离心8 min后收集菌体，用1/2 MS液体培养液洗菌体1次(低温下进行)，弃上清液，收集菌体，再次加入1 /2 MS液体培养液，使其稀释倍数为原菌液体积的1.0×作为侵染菌液的浓度，在28 ℃ 75 r·min-1条件下加入浓度为0、100、200、300 μmol·L-1乙酰丁香酮活化菌液2 h。

1.2.4 受体材料侵染 在超净工作台上，将预处理过的铁皮石斛原球茎放入已活化的菌液中，在28 ℃ 75 r·min-1下横摇10、20、30 min。倒掉菌液，滤出原球茎，转移到1/2MS培养基上28 ℃暗培养48 h，至原球茎下长出农杆菌菌丝。

挑取带有菌丝的原球茎置于无菌三角瓶中，无菌水冲洗至肉眼看不到菌丝，再用25 mg·L-1Mer冲洗3次，除去剩余农杆菌，期间不断振荡，最后1次冲洗后静止30 min，让粘附于原球茎的农杆菌扩散到水里，最后用50 mg·L-1Mer浸泡30 min，期间不断震荡，然后将原球茎挑出至无菌滤纸上吸干多余水分，再将原球茎分别接种于含有质量浓度为20、30、50 mg·L-1Mer和PPT的分化培养基中，置于25 ℃的光照培养箱中培养，使其分化，产生不定芽，定期观察并记录结果。

1.2.5 GUS染色检测 取共培养3 d后的原球茎与未转基因原球茎分别放到Eppendorf管中，加入5 mL反应液(0.025 mg·L-1X-gluc 200 μL，0.1 mg·L-1铁氰化钾2.5 μL，0.1 mg·L-1亚铁氰化钾2.5 μL，0.1 mg·L-1磷酸盐缓冲液4.79 mL，TritonX-100 5 μL)，在37 ℃下过夜，用无水乙醇脱色，观察并统计染色情况。

1.2.6 PCR检测 取100 mg对照植株及转基因植株叶片，经液氮冷冻充分研磨后用快速植物基因组试剂盒提取DNA，根据GUS基因序列设计PCR引物，上游5’-GGTCACTCATTACGCAAAGT-3’，下游5’-ACTCCACATCACCACGCTT-3’，PCR扩增产物总长为989 bp。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛原球茎PPT筛选压力的确定

将铁皮石斛原球茎放入含有不同质量浓度的PPT培养基中进行抗性筛选，2个月后观察原球茎的生长情况并计算死亡率。结果显示，在0.5 mg·L-1PPT的培养基上，原球茎能够保持绿色，正常生长；PPT质量浓度为1.0 mg·L-1时对铁皮石斛原球茎的增殖和分化有抑制作用，原球茎PLBs存活率为56.76%，一部分PLBs表现出发白或黄化，不能继续生长；当PPT质量浓度在2.0 mg·L-1以上，PLBs全部死亡。由图1可知，PPT质量浓度为2.0 mg·L-1时对铁皮石斛原球茎筛选效果最好，可明显区分转化与未转化铁皮石斛原球茎的有效筛选压。

图1 不同PPT质量浓度对铁皮石斛原球茎死亡率的影响Fig.1 Effect of PPT concentration on the death rate of Dendrobium officinale protocorms

2.2 原球茎预处理方法的选择

在超净工作台上，分别使用刀切、针刺、摁压3种方法对播种30 d后又经过暗培养3 d的铁皮石斛原球茎作预处理，然后放入质量浓度为1.0的菌液中侵染30 min，共培养2 d后去除多余农杆菌菌丝并转移到含Mer和PPT的分化培养基上，30 d后观察原球茎生长情况。结果如表1所示，摁压法处理的原球茎存活率最高，达86.27%，适合铁皮石斛原球茎的遗传转化体系。

表1 预处理方法对原球茎存活率的影响 Table 1 Effects of different treatments on the survival of Dendrobium officinale protocorms

2.3 菌液浓度对原球茎遗传转化的影响

将原球茎分别放入浓度为0.6、0.8、1.0、1.2 μmol·L-1的菌液中进行侵染，结果如表2所示。农杆菌菌液OD600值在0.6～1.0时，随OD600值的增加，GUS瞬时表达量呈上升趋势，菌液浓度OD600为1.0时，GUS的瞬时表达率最高，可达22.22%。但OD600值超过1.0时，瞬时表达率下降明显， OD600值为1.2时表达率是OD600为1.0时的0.45倍。

表2 不同菌液浓度对GUS瞬时表达率的影响Table 2 Effects of bacterial concentration on transient expression of GUS

2.4 乙酰丁香酮对铁皮石斛原球茎遗传转化的影响

在活化菌液时，AS浓度对转化率的影响结果如表3所示。在不添加AS的情况下，转化率只有12.50%，添加AS后转化率明显比不添加AS要高，说明添加AS在一定范围内可提高铁皮石斛农杆菌遗传转化率，当添加浓度为200 μmol·L-1效果最佳，转化率为58.82%，当AS浓度达到300 μmol·L-1时，转化率是浓度为200 μmol·L-1的0.32倍。因此，200 μmol·L-1为最适宜浓度。

表3 铁皮石斛预培养不同浓度AS对GUS染色效率的影响 Table 3 Effect of preculture with different concentration of AS on GUS histochemical staining of protocorms of Dendrobium officinale

2.5 不同侵染时间对转化效率的影响

将原球茎放入菌液中后，农杆菌需要经过一段时间才能附着，而侵染时间的长短会直接影响转化效率。由试验结果可知，随着浸泡时间的延长，GUS瞬时表达率随之增大，在30 min时最高，达到9.84%；当时间延长到60 min时,表达率低于10 min的表达率，且外植体褐化死亡增多。

2.6 美罗培南抑菌剂质量浓度的选择

美罗培南可以有效抑制农杆菌的生长，为原球茎的生长提供良好坏境。将与农杆菌共培养后的铁皮石斛原球茎放入含有质量浓度20、30、50 mg·L-1美罗培南的培养基中，结果如表4所示。美罗培南质量浓度为30 mg·L-1时，农杆菌除菌率高，分化率也最高，达76﹪； 在美罗培南质量浓度为50 mg·L-1时，农杆菌菌落数为0，但是原球茎分化率降低，说明高质量浓度的美罗培南能降低外植体的分化率，抑制原球茎的再生。

表4 Mer质量浓度对农杆菌侵染原球茎的影响 Table 4 Effect of Mer on Agrobacterium-infected protocorms

2.7 GUS活性检测

由GUS组织化学染色可知(图2)，有抗性的铁皮石斛原球茎上的蓝色斑点多而集中(图2-A)，未转化的对照原球茎未变蓝色(图2-B)，可初步证明图2-A中农杆菌介导的铁皮石斛基因侵染成功。

图2 铁皮石斛原球茎GUS组织化学染色Fig.2 GUS histochemical staining of protocorms of Agrobacterium-infected Dendrobium officinale

2.8 PCR检测

将获得的5株具有PPT抗性的再生植株及未转化植株提取DNA(图3)。PCR结果显示(图4)，3株能特异性地扩增989 bp的条带，与质粒PCR扩增出的条带完全相同。而未转基因植株无条带出现，因此初步证明这3株铁皮石斛为阳性转化植株。

1～5：转化植株；6：未转化植株。 1 to 5: Transformed plant;6: Untransformed plant.

3 讨论

在建立成熟高效的农杆菌转化体系过程中，选择出最优的侵染条件是十分必要的。对影响转化效率诸因素的研究发现：(1)由于铁皮石斛原球茎生长紧实，不易侵染，摁压处理后的原球茎转化率最高，这可能是因为针刺处理的伤口过小，农杆菌无法有效地侵染到原球茎；刀切处理也有可能对原球茎伤害过大导致不能正常生长，死亡率增加。(2)侵染时间为30 min时转化效率最高，到60 min时反而下降，这表明侵染时间过短，T-DNA未能成功转入植物基因组内，而时间过长，农杆菌过多生长对原球茎造成毒害作用[10]，这一结果与冯莹[11]的研究一致。(3)乙酰丁香酮可诱发农杆菌内Ti或Ri质粒DNA上Vir区基因的活化和高效表达，促进农杆菌T-DNA向宿主细胞核转移，从而提高遗传转化效率[12,13]。而单子叶植物由于不分泌酚类物质或酚类物质含量低而不能诱导 Vir 基因的活化, 因此可以通过添加乙酰丁香酮对单子叶植物进行转化，而刘小琳等[14]，黄天带等[15]的研究结果认为AS的添加不能提高转化效率，这可能与受体材料的类型差异有关。本试验结果显示，添加浓度为200 mol·L-1的乙酰丁香酮可显著提高抗性原球茎获得率，但是AS浓度过高转化率会下降，其原因可能是高浓度的AS使农杆菌侵染活力增强，使转化的植物细胞受到农杆菌的毒害而无法生存,而且较高浓度的AS对农杆菌的生长也有影响。(4)张振华等[16]和MEN等[17]用农杆菌转化石斛时，也是使用相对较高浓度(OD600为0.8～1.2)的菌液，但CHAI等[18]认为，使用低浓度菌液侵染可以避免因农杆菌在共培养时过度繁殖而引起的原球茎死亡。本研究发现农杆菌菌液OD600值为1.0时的浓度具有较高的转化效率，且未发现因农杆菌过度生长而导致难除菌的问题。

1：pCAMBIA3301-RTACS质粒；2～6：转化植株；7：未转化植株；M:mark DL2000。 1:pCAMBIA3301-RTACS plasmid;2 to 6: Transformed plant;7:Untransformed plant;M:Mark DL2000.

本试验在前人的研究基础上，参考其他植物农杆菌介导的遗传转化的影响因素，设计试验对铁皮石斛遗传转化体系进行研究[19-23]。GUS基因PCR结果显示，并不是所有侵染植株表现出阳性反应，仍然有假转化体存在，假转化体的产生是目前遗传转化中非常普通的现象，需要更深层次的研究进行改善。本研究为铁皮石斛的转基因提供了技术平台，也为铁皮石斛新品种开发奠定了基础，但是对植株新性状的获得还需要更进一步的研究。

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(责任编辑：朱秀英)

Study onAgrobacterium-mediated transformation system ofDendrobiumofficinale

CUI Bo1,2, LIU Jia2， WANG Jieqiong2， JIANG Suhua1， WU Zhenjiang2， YE Yongzhong2

(1.Zhengzhou Normal College，Zhengzhou 450044，China; 2.College of Life Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China)

Using the protocorms ofDendrobiumofficinaleas recipient materials, the genetic transformation system ofDendrobiumofficinalewithAgrobacterium-mediated method was studied, and such influencing factors as PPT’s resistant pressure, infection concentration of bacteria, concentration of AS, treatment methods of protocorms, infection time and concentration of Mer of the system were also optimized. The results showed that the press-treated protocorms were infected successfully by using the screening medium which contained 50 mg·L-1Mer and 2.0 mg·L-1PPT after being treated withAgrobacteriumtumefacienssuspension (OD600=1.0, added 200 μmol·L-1AS) for 30 min and co-cultured for 48 h.GUS histochemical staining and PCR analysis of the regenerated plants confirmed that the ACC synthase antisense gene had been introduced into theDendrobiumofficinalegenome.

Dendrobiumofficinale; protocorms; ACC synthase; genetic transgenic；transformation system optimization

2014-10-14

郑州市科技攻关项目(074SGYS33205-2)；河南省重点科技攻关项目(092102110128)

崔 波(1962-)，男，河南泌阳人，研究员，主要从事花卉分子生物学研究。

叶永忠(1957-)，男，湖北黄冈人，教授，博士生导师。

1000-2340(2015)02-0208-05

S435.72

A