TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导I型干扰素中的作用

何汉文，王　葱，杜博易，吴　璇，于　莉，汪旻旻，黄升海

TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549细胞诱导I型干扰素中的作用

何汉文1，王葱2，杜博易2，吴璇1，于莉1，汪旻旻1，黄升海1

摘要目的探讨Toll样受体7（TLR7）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染A549细胞诱导产生I型干扰素（IFN）抗病毒免疫反应中的作用。方法实验分正常对照组、RSV感染组、TLR7 siRNA沉默组，分别于感染的4、8、12、24 h后收集各组细胞以及培养上清液。TLR7 siRNA通过瞬时转染A549细胞，半定量RT-PCR法检测TLR7基因沉默效果；TRIzol试剂提取细胞总RNA，检测TLR7、干扰素调节因子7（IRF7）、IFN-α、IFN-β的mRNA表达量变化；通过Western blot法检测TLR7蛋白表达量；ELISA法检测感染不同时间点A549细胞培养上清液中IFNα／β含量的变化。结果①转染24 h后TLR7 siRNA-2有效抑制TLR7mRNA表达；②RSV感染A549细胞后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA以及 TLR7蛋白的表达量均升高，并与RSV感染之间存在时间依赖性关系；沉默TLR7后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的mRNA以及TLR7蛋白的表达量较感染组均有明显下降；③RSV感染A549细胞后，明显上调细胞培养上清液中IFN-α／β的水平，TLR7 siRNA沉默组IFN-α／β的表达水平较RSV感染组均下降，差异有统计学意义，且IFN-α的表达量下调更为显著。结论RSV感染A549细胞后，TLR7被活化能够诱导产生I型IFN，发挥抗病毒作用，且TLR7诱导产生的I型IFN以IFN-α为主。

关键词呼吸道合胞病毒；A549细胞；Toll样受体7；siRNA；I型干扰素

2015-06-20接收

黄升海，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：huangshh68＠aliyun．com

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一种有包膜单负链的RNA病毒，属于副黏病毒科肺炎病毒属［1］，是世界范围内婴幼儿严重下呼吸道感染（包括肺炎和细支气管炎）的最常见病原体［2-3］。目前RSV感染的病理机制尚不明确，迄今仍无理想的治疗药物和疫苗。Toll样受体7（Tolllike receptor 7，TLR7）可通过识别病毒的单股RNA而活化细胞［4-5］，诱导I型干扰素（interferon，IFN）产生，活化核转录因子κB（nuclear factor ofκB，NF-κB）的表达，从而介导免疫炎症反应。本实验通过RNAi沉默TLR7表达，研究RSV感染A549细胞后TLR7的活化，探讨其活化所介导的I型IFN产生机制及其抗病毒作用，为临床RSV感染的预防与治疗提供思路。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1细胞和病毒人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549、人喉癌上皮细胞（Hep-2）和RSV-Long株（国际标准株）均由安徽医科大学微生物学教研室保存。

1．1．2主要试剂DMEM培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季清公司）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）；TLR7 siRNA（上海百奥迈科生物科技有限公司）；逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）；IFN-α／β酶联检测试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；抗TLR7抗体、抗β-actin（美国Santa Cruz公司）；HRP-羊抗兔IgG（碧云天生物技术有限公司）；其他试剂为市售分析纯。

1．2方法

1．2．1病毒感染量测定将冻存的RSV-Long株与37℃水浴复苏后经Hep-2细胞增殖，病变达80%～90%时收获病毒，-80℃保存备用。空斑形式试验（plaque forming unit，PFU）检测病毒增殖滴度为1．55×108／ml。

1．2．2细胞培养与实验分组将冻存的A549细胞复苏后接种于细胞瓶中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞长至80%～90%用于实验。实验分正常对照组（同等条件下培养的未感染病毒细胞）、RSV感染组、TLR7 siRNA沉默组（TLR7 siRNA ＋RSV组）。

1．2．3细胞转染条件的优化与转染取对数生长期的A549细胞，用胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液接种于96孔板，用不含抗生素的含血清的DMEM培养。待细胞长至80%时，弃去含血清的细胞培养液，用预冷的PBS洗涤3次，用无血清无抗生素的DMEM培养液进行转染，Lipofectamine 2000与带有FAM标记的siRNA分别用opti-MEM进行稀释，孵育20 min后，形成Lipofectamine2000-siRNA复合物，均匀加入培养基，放入CO2孵箱中培养，6 h后更换完全培养基。转染24 h后，将细胞置于荧光显微镜下观察转染效率，用于优化细胞的转染条件。

以TLR7为靶向沉默基因，设计并合成3条TLR7 siRNA干扰序列以及1条siRNA空白对照序列，取转染24 h后细胞，提取细胞总RNA，利用RTPCR法检测TLR7 mRNA的表达，筛选出能有效抑制TLR7基因的干扰序列，以期达到阻断TLR7信号通路的目的。

1．2．4TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β的mRNA水平检测收集细胞，按TRIzol试剂盒说明书提取细胞总RNA，分光光度计法检测RNA的纯度与浓度，取1 μg总RNA按逆转试剂盒说明书程序进行：42℃45 min，95℃5 min，4℃5 min合成cDNA。反应结束后，将逆转录结果体系按1∶5稀释，进行PCR扩增，以人β-actin的mRNA表达作为内参。PCR扩增产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳分析，经凝胶成像分析仪扫描拍照后，用Labworks软件分析测定条带的灰度值，以目的基因与β-actin的比值对mRNA表达水平进行半定量分析。各基因的引物序列和扩增片断长度见表1，各基因的PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，退火时间为45 s，72℃延伸1 min，35个循环，TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β、βactin退火温度为：55℃、55℃、57．7℃、57℃、49．4℃。

表1　人各基因的引物序列和扩增片段大小

1．2．5不同感染条件下各组细胞不同时间点TLR7蛋白的表达分别收集正常对照组和不同感染条件各组不同时间点的A549细胞并进行裂解，冰上孵育30 min后，离心收集上清液，煮沸5 min，进行SDS-PAGE电泳；然后将蛋白转移至PVDF膜，转膜后用5%的脱脂奶粉，室温下封闭1 h，分别加入TLR7（1∶500）、β-actin（1∶500）一抗，4℃孵育过夜。洗膜后，ECL显影后曝光并显影，用Labworks软件分析测定灰度值，进行分析。

1．2．6不同条件下细胞培养上清液中IFN-α／β的表达收集各实验组细胞培养上清液，离心后去除沉淀，分装EP管，-80℃保存，应避免反复冻融。严格按照ELSIA试剂盒说明书进行操作，酶标仪读取吸光度值，计算出IFN-α／β的表达水平。

1．3统计学处理采用SPSS 19．0软件进行分析，数据以±s表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。

2　结果

2．1转染效率的检测利用荧光显微镜观察FAM标记的siRNA转染A549细胞，转染24 h后细胞中出现明显的FAM标记的绿色荧光，普通光源下的A549细胞对比荧光明场下的绿色荧光细胞，siRNA的转染效率为90%（图1），初步认为设计合成的FAM-siRNA已成功转入细胞内。

2.2TLR7 siRNA转染A549细胞后TLR7mRNA表达情况TLR7 siRNA-1、TLR7 siRNA-2、TLR7 siRNA-3和siRNA空白对照分别转染A549细胞，24 h后对TLR7基因进行RT-PCR检测结果显示，TLR7 siRNA-2组较其他组抑制作用最强，可以更有效地抑制TLR7 mRNA的表达，后续转染实验选择TLR7 siRNA-2为最佳的转染序列（图2）。

2.3RSV感染不同时间点各组TLR7 m RNA的表达RT-PCR测定结果显示，正常对照组的A549细胞的 TLR7表达很低；在RSV感染组TLR7 mRNA的表达量随时间延长而逐渐增加，有时间依赖性；与正常对照组比较，感染4 h后A549细胞中的TLR7 mRNA转录水平逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0．01）。在TLR7 siRNA沉默组，TLR7 mRNA的表达水平虽有所增加，但较RSV感染组同时间点表达量显著降低，差异有统计学意义（F＝35．08，P＜0．01），见图3。

2.4不同时间点各组IRF7 mRNA的表达正常对照组A549细胞中的IRF7 mRNA表达量较低；与正常对照组比较，RSV感染组IRF7mRNA表达量可随时间延长呈上调趋势；在RSV感染A549细胞4 h后，各时间点IRF7 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0．01）；在TLR7 siRNA沉默组，IRF7 mRNA表达尽管有上升的趋势，但较RSV组明显降低，差异有统计学意义（F＝29．91，P＜0．01），见图4。

2.5IFN-αmRNA在各组不同时间点的表达RT-PCR测定结果显示，正常对照组中IFN-αmRNA的表达量很低；RSV感染组与正常对照组比较，IFN-αmRNA的表达量升高且有时间相关性，8 h后IFN-αmRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0．01）；在 TLR7 siRNA沉默组，IFN-αmRNA的表达较RSV感染组的表达量显著下降，8 h后降低，差异有统计学意义（F＝11．46，P＜0．05）。见图5。

2.6IFN-βm RNA在各组不同时间点的表达正常对照组的A549细胞的IFN-βmRNA表达基线很低；RSV感染组IFN-βmRNA的表达量升高且具有时间依赖性。RSV感染4 h后，IFN-βmRNA表达水平均高于正常对照组，各时间点差异有统计学意义（P＜0．05）；在TLR7 siRNA沉默组，经TLR7 siRNA转染后，细胞表达IFN-βmRNA的量虽较正常对照组高，但与RSV感染组各时间点比较明显下降，在转染8 h后IFN-βmRNA的表达量降低，差异有统计学意义（F＝11．72，P＜0．05）。见图6。

2.7TLR7在各组不同时间点的蛋白水平变化TLR7蛋白在正常A549细胞中表达非常低，经RSV感染后，TLR7蛋白的表达量随着感染时间的增加，不断上调（P＜0．01），RSV感染A549细胞后，不同感染时间点TLR7蛋白表达量均高于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0．01）；在TLR7 siRNA沉默组，各时间点均检测到TLR7蛋白表达量，但较RSV感染组明显下降，差异有统计学意义（F＝26．90，P＜0．01）。见图7。

2.8不同条件下细胞培养上清液中IFN-α／β水平的改变ELSIA法检测A549细胞培养上清液中IFN-α／β的表达水平变化，RSV感染组IFN-α／β的表达量较正常对照组逐渐升高，具有时间依赖性。RSV感染组和正常对照组比较，感染的4 h后检测到IFN-α／β表达水平逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0．05），12 h后升高有统计学意义（P＜0．01）。在TLR7 siRNA沉默组，不同感染时间点IFN-β的表达量均低于RSV感染组，24 h后有统计学意义（F＝7．845，P＜0．05）。在各感染时间点TLR7 siRNA沉默组，IFN-α的表达量均低于RSV感染组，12 h后差异有统计学意义（F＝6．181，P＜0．05），且IFN-α下降的更为明显。见图8。

3　讨论

RSV是引起世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最主要病原体之一，感染后可诱导宿主表达大量的细胞因子等生物活性介质，导致严重的细支气管炎、肺炎、哮喘等疾病［6］。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一类进化保守的模式识别受体，能识别和启动不同病原体的相关模式分子，随后诱导TLRs依赖的基因表达，通过级联反应，进而引起I 型IFN和促炎症细胞因子的表达，介导先天性免疫和调节适应性免疫应答来防御病毒的感染［7］。I型IFN中IFN-α和IFN-β是发挥早期抗病毒和调节免疫活性的主要效应分子，IRF调控干扰素基因的转录表达，其中 IRF7活化IFN-α启动子，导致Ⅰ型IFN和其他细胞因子的表达和分泌，介导抗病毒免疫应答。但目前对RSV感染诱导干扰素产生及其在RSV致病中的作用仍不明确。已有研究［8-10］表明在RSV感染婴幼儿的鼻咽洗液中检测到I型IFN表达，IFN甚至可以引起免疫病理反应。因此，探讨TLR7活化在介导的Ⅰ型IFN的产生机制及其在RSV致病中的作用，具有非常重要的意义。

本实验研究表明，RSV感染A549细胞时可活化上调TLR7、IRF7、IFN-α／β的mRNA和TLR7的蛋白表达以及和培养上清液中IFN-α／β；在加入TLR7 siRNA后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的表达较RSV感染组明显下调，说明沉默TLR7后，下调了IRF7的表达，进而导致IFN的产生减少，起到的抗病毒作用降低。当A549细胞受到RSV感染时，TLR7识别病毒的ssRNA，主要通过级联反应将信号传递给IRF7，导致I型IFN的表达分泌，介导抗病毒作用。这与Davidson et al［11］在小鼠肺炎病毒感染BALB／c小鼠诱导急性肺炎的研究结果中TLR7的作用相一致。本课题组用TLR7 siRNA特异性沉默了TLR7的表达，研究其在RSV感染A549细胞中诱导I型IFN的抗病毒作用，更进一步说明了TLR7的作用。

通过研究显示，用TLR7 siRNA抑制了TLR7mRNA表达后，IFN-α／β的表达虽然均有下调，但IFN-α表达较IFN-β更显著下调，表明由TLR7诱导产生的最主要I型IFN可能是IFN-α，且I型IFN的表达至少是部分依赖TLR7活化，TLR7可能为诱导产生IFN抗病毒作用中的一个关键因素。进一步研究TLR7在机体抗病毒感染中的作用，可为临床治疗RSV感染及研发抗RSV新药提供重要思路。

参考文献

［1］Wong TM，Boyapalle S，Sampayo V，et al．Respiratory syncytial virus（RSV）infection in eldly mice results in altered antiviral gene expression and enhanced pathology［J］．PLoSOne，2014，9 （2）：e88764．

［2］Nair H，Nokes D J，Gessner B D，et al．Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children：a systematic review and meta-analysis［J］．Lancet，2010，375（9725）：1545-55．

［3］Hall C B．Respiratory syncytial virus in young children［J］．Lancet，2010，375（9725）：1500-2．

［4］Lund JM，Alexopoulou L，Sato A，et al．Recognition of singlestranded RNA viruses by Toll-like receptor7［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2004，101（15）：5598-603．

［5］Crozat K，Beutler B．TLR7：A new sensor of viral infection［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2004，101（18）：6835-6．

［6］黄升海，刘伟，史晓佾，等．呼吸道合胞病毒感染巨噬细胞诱导炎性基因表达的部分机制研究［J］．中国人兽共患病学报，2009，25（10）：948-52．

［7］Meylan E，Tschopp J．Toll-like receptors and RNA helicases：two parallelways to trigger antiviral responses［J］．Mol Cell，2006，22（5）：561-9．

［8］Scagnolari C，Midulla F，Trombetti S，et al．Upregulation of interferon-induced genes in infants with virus-associated acute bronchiolitis［J］．Exp Biol Med（Maywood），2007，232（10）：1355 -9．

［9］Scagnolari C，Midulla F，Pierangeli A，et al．Gene expression of nucleic acid-sensing pattern recognition receptors in children hospitalized for respiratory syncytial virus-associated acute bronchiolitis［J］．Clin Vaccine Immunol，2009，16（6）：816-23．

［10］Welliver R C Sr．The immune response to respiratory syncytial virus infection：friend or foe？［J］．Clin Rev Allergy Immunol，2008，34（2）：163-73．

［11］Davidson S，Kaiko G，Loh Z，et al．Plasmacytoid dendritic cells promote host defense against acute pneumovirus infection via the TLR7-MyD88-dependent signaling pathway［J］．J Immunol，2011，186（10）：5938-48．

The role of TLR7 in A549 cellsw ith the respiratory syncytial virus infection induced type I interferon

He Hanwen1，Wang Cong2，Du Boyi2，et al
（1Dept of Microbiology，2School of Life Sciences，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveThis experimentwas designed to explore the antiviral effect of TLR7 when A549 cellswere infected by respiratory syncytial virus（RSV）to induce the production of type I interferon（IFN）．MethodsThis experimentwas divided into normal control group，RSV infection group and TLR7 silence group．In each group cell and culture supernatantwere collected after having been infected for 4，8，12 and 24 h．TLR7 siRNA was transfected in A549 cells by transient transfection．With the use of the RT-PCR assay，TLR7 gene silencing effect could be detected；with the use of Trizol reagent，the totalRNA could be extracted and the expression dynamicsofmRNA in TLR7，IRF7，IFN-αand IFN-βcould be detected；with the use of Western blot，protein expression could be tested；with the use of ELISA，the variation of IFNα／βin the culture supernatant of A549 cells infected in the different points of time could be detected．Results①24 h after transfection，TLR7 siRNA-2 could restrain the expression of TLR7 mRNA effectively with statistical significance．②The expression ofmRNA in TLR7，IRF7 and IFN-α／β，togetherwith TLR7 protein，which existed time dependent relation with RSV infection，had increased after A549 cells had been infected by RSV．Meanwhile，compared with RSV infection group，the expression ofmRNA in TLR7，IRF7 and IFN-α／β，togetherwith TLR7 protein had decreased obviously in TLR7 silence group．③Compared with RSV infection group，the expression of IFN-α／βin cell culture supernatant and in TLR7 silent group had decreased，and the expression of IFN-αdecreased obviously．Itwentwithout saying that the difference of decrease in two groups had statistical significance．ConclusionAfter cell A549 have been infected by RSV，TLR7 could be activated and then induce type I interferon after having been infected by RSV，which play the role in anti-virus．Noticeably，IFN-αaccounts for themost of e type I interferon．

Key wordsrespiratory syncytial virus，A549 cells；Toll-like receptors 7；siRNA；Type I interferon

中图分类号R 373．14

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1560-06

基金项目：安徽高校省级自然科学研究重点项目（编号：KJ2012A152）；安徽省自然科学基金（编号：1308085MH129）；安徽省级大学生创新创业训练计划项目（编号：AH201410366135）

作者单位：安徽医科大学1基础医学院生物学教研室、2生命科学学院2012级生物技术专业，合肥230032

作者简介：何汉文，男，硕士研究生；