血吸虫果糖二磷酸醛缩酶诱导Th2免疫偏移的研究

胡媛媛，徐元宏，沈继龙，陈　鹤

血吸虫果糖二磷酸醛缩酶诱导Th2免疫偏移的研究

胡媛媛1，徐元宏1，沈继龙2，陈鹤2

摘要目的分析日本血吸虫感染以及虫源性糖蛋白果糖二磷酸醛缩酶（SjFBPA）刺激后小鼠脾脏细胞中白介素4 （IL-4）、白细胞分化抗原CD8a因子表达量的动态变化，并探讨SjFBPA与辅助型T细胞（Th2）免疫应答的关系。方法血吸虫尾蚴感染C57小鼠10只，设正常对照组。感染8周后处死小鼠，取脾脏制备淋巴细胞悬液；用藻红蛋白（PE）标记CD8a抗体，藻青蛋白（APC）标记IL-4抗体进行细胞染色；流式细胞仪检测细胞因子表达量的变化。10只正常C57小鼠处死后取脾脏制成淋巴细胞悬液，加SjFBPA蛋白体外刺激，按上述流程刺激方法检测细胞。结果小鼠感染血吸虫8周后脾细胞中IL-4、CD8a的表达量分别为（22．39± 5．93）%、（11．34±2．15）%，正常对照组脾细胞中IL-4、CD8a的表达量分别为（1．39±0．52）%、（1．98±0．84）%，差异有统计学意义（P＜0．01）。SjFBPA体外刺激小鼠脾细胞的IL-4、CD8a的表达量分别为（14．14±1．16）%、（8．99± 0．81）%，正常对照组脾细胞中IL-4、CD8a的表达量分别为（1．86±0．93）%、（1．69±0．56）%，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论SjFBPA在血吸虫感染中具有诱导Th2免疫偏移的作用，树突状细胞作为提呈细胞参与该免疫反应。

关键词日本血吸虫；虫源性糖蛋白果糖二磷酸醛缩酶；Th2型免疫应答

2015-07-31接收

2安徽人畜共患病研究所，合肥230032

徐元宏，男，教授，主任技师，博士生导师，E-mail：xyhong1964＠163．com

血吸虫病是一种由虫卵肉芽肿引起的慢性免疫性疾病，严重危害人类健康，全球大约有2亿人感染血吸虫，其中1．2亿人有典型症状［1］。其病理基础是沉积于组织中成熟虫卵内毛蚴分泌的可溶性虫卵抗原（soluble eggs antigen，SEA），诱发宿主发生免疫应答后形成虫卵肉芽肿。血吸虫感染早期以1型辅助T细胞（T helper cells，Th1）反应为主；血吸虫尾蚴感染6周时雌虫开始产卵，宿主出现以Th2型细胞反应为主的优势应答，体内Th2型细胞因子分泌增多。第8～9周后，Th2应答达到高峰，此后Th1 和Th2型细胞因子分泌水平均有所下降；第12周后虫卵内毛蚴死亡，SEA逐渐减少至消失，肉芽肿体积减小，形成局部纤维化。发生Th1型向Th2型的免疫偏移。虫源性糖蛋白果糖二磷酸醛缩酶（schistosome fructose bisphosphate aldolase，SjFBPA）是糖代谢中重要的糖裂解酶，参与寄生虫能量的产生，对寄生虫的生存和活动至关重要［2］。树突状细胞（dendritic cell，DC）是一种专职抗原提呈细胞，在激活T、B细胞的特异性免疫反应及免疫耐受中均起着重要作用［3］。成熟DC激活T细胞能力很强，主要诱导免疫应答。该研究探讨 SjFBPA对 Th2免疫偏移的影响以及作用途径。

1　材料与方法

1．1动物与蛋白日本血吸虫感染钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所，常规方法逸出尾蚴，用于感染小鼠。20只健康C57小鼠购于安徽医科大学实验动物中心，6～8周龄，雄性，在清洁级环境下喂养。

1．2试剂DMEM培养基为美国Hyclone公司产品；新生及胎牛血清为杭州天杭生物科技有限公司产品；青霉素钠及硫酸链霉素、FITC标记CD4抗体、APC标记IL-4抗体、PE标记的CD8a抗体均来自美国Sigma公司。

1．3方法

1．3．1血吸虫感染小鼠将20只小鼠随机分为两组，每组10只，一组经腹部感染日本血吸虫尾蚴15条，另一组作为空白对照组。于感染第8周后处死小鼠并制备脾单细胞悬液，PBS调整细胞数为5× 106个／m l。

1．3．2SjFBPA蛋白纯化用实验室保存的菌种进行摇菌扩增，观察菌液光密度值（optical density，OD）大于0．6后加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）诱导蛋白表达，8 h后收集菌液超声破碎离心取上清液进行层析纯化，纯化后取蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶分析鉴定及凝胶定量软件quantityone纯度测量，其余蛋白放入-80℃保存备用。

1．3．3FBPA蛋白刺激取正常小鼠脱臼处死，取脾脏制备脾单细胞悬液，PBS调整细胞数为5×106个／m l。加入12孔板中，纯化FBPA蛋白，每孔分别加1μg LPS＋1μg FBPA，37℃ CO2培养箱共培养24 h。

1．3．4细胞染色将处理完的脾细胞悬液经1 800 r／min离心10 min弃上清液后收集进流式管中，相同条件处理的脾脏细胞分为两批，一批每管加入1 μl FITC标记的CD4抗体，4℃避光20 min，用500 μl Stain Buffer洗涤两次后做打孔破膜处理：每管加100μl破膜液，4℃避光20 min，再加入APC标记IL-4抗体，Wash Buffer洗涤两次，加入500μl Stain Buffer后等待上机测量；另一批每管分别加入1μl FITC标记的CD11c抗体、PE标记的CD8a抗体4℃避光20 min后，Wash Buffer洗涤两次，加入500μl Stain Buffer后等待上机测量。

1．3．5流式细胞仪检测先根椐物理参数设活细胞门，然后以CD4设定CD4＋T细胞亚群，检测CD4＋T细胞亚群中细胞因子的表达率。再选出Lin-CD11c＋细胞，进一步分析这群 Lin-CD11c＋细胞中CD8α表达情况。每次检测前均用荧光微球对流式细胞仪进行光路和流路质控监测，保证仪器处于正常的工作状态。

1．4统计学处理采用SPSS 11．0统计软件对数据进行整理和分析，组间比较采用t检验。

2　结果

2.1FBPA蛋白纯化以及浓度测定12%SDSPAGE凝胶分析图及quantityone对凝胶图谱进行分析，结果显示目的蛋白相对含量为92%。见图1。

2.2FBPA蛋白刺激小鼠脾脏细胞悬液后IL-4的表达量与正常脾脏细胞悬液的对比正常对照组的小鼠脾脏细胞悬液中IL-4的表达量为（1．86± 0．93）%，而FBPA刺激后的小鼠脾脏细胞悬液中IL-4的表达量为（14．14±1．16）%，FBPA刺激后的细胞因子IL-4表达量明显增多（t＝38．165，P＜0．01），提示出现Th2免疫偏移特征。见图2。

2.3血吸虫感染8周后小鼠脾脏细胞悬液的IL-4的表达量与正常脾脏细胞悬液的对比正常脾脏细胞悬液的IL-4的表达量为（1．39±0．52）%，血吸虫感染8周后小鼠脾脏细胞悬液中IL-4的表达量为（22．39±5．93）%。血吸虫感染后8周的IL-4表达量明显变化（t＝8．878，P＜0．01），提示已经呈Th2免疫偏移。见图3。

2.4不同处理组小鼠脾脏细胞悬液中IL-4的含量百分比的对比正常脾脏细胞悬液的IL-4含量百分比较低，而血吸虫感染8周后以及用FBPA刺激后的小鼠脾脏细胞悬液中IL-4含量百分比明显升高，并且血吸虫感染8周比FBPA单一蛋白刺激的效果更为明显。见图4。

2.5FBPA蛋白刺激小鼠脾脏细胞悬液后CD8a的表达量与正常脾脏细胞悬液的对比正常脾脏细胞悬液的CD8a的表达量为（1．69±0．56）%，FBPA蛋白刺激小鼠脾脏细胞悬液后的CD8a的表达量为（8．99±0．81）%。FBPA蛋白刺激的细胞因子CD8a表达量明显变化（t＝15．695，P＜0．01），提示参与提呈作用的DC细胞活化增多。见图5。

2.6血吸虫感染8周后小鼠脾脏细胞悬液的CD8a的表达量与正常脾脏细胞悬液的对比正常脾脏细胞悬液的CD8a的表达量为（1．98± 0．84）%，血吸虫感染8周后小鼠脾脏细胞悬液的CD8a的表达量为（11．34±2．15）%。血吸虫感染后8周的细胞因子CD8a表达量明显变化（t＝10．511，P＜0．01），提示参与提呈作用的DC细胞活化增多。见图6。

2.7不同处理组小鼠脾脏细胞悬液中CD8a＋的含量百分比的对比正常对照组脾脏细胞悬液的CD8a＋含量百分比较低，而血吸虫感染8周后以及用FBPA刺激后的小鼠脾脏细胞悬液中CD8a＋含量百分比明显升高，由于血吸虫感染是综合作用，相比FBPA单一蛋白刺激的效果更为明显。见图7。

3　讨论

蠕虫感染诱导的宿主Th2免疫偏移已成为感染免疫调节研究的重要模型。研究［4-6］显示，血吸虫对Th1介导的自身免疫性疾病和Th2介导的过敏症均有抑制作用，有研究［7］表明Th2优势应答出现在雌虫产卵后，因此有研究者认为，虫卵是诱导Th2应答的主要成分。但是，曼氏血吸虫感染4周（尚未产卵）即出现Th2应答，单性尾蚴感染也可激发Th2优势应答［8］。提示单个虫体表膜和分泌排泄抗原（ESA）中的糖脂以及糖蛋白可能是促进Th2免疫偏移的主要诱导分子。成熟DC激活T细胞能力很强，主要诱导免疫应答，而不成熟DC可诱导免疫耐受。近年来又提出了DC1和DC2的亚类分类的概念，认为DC1为髓系来源的DC，表达髓系标志，主要诱导Th1型应答；DC2为淋巴系来源的DC，表达淋巴系的表面标志如CD8分子（CD8a），具有诱导Th2型应答，参与免疫调节和免疫耐受的功能，在小鼠实验中表达淋巴系表面分子CD8α的DC细胞被认为是 DC2。本实验中SjFBPA体外刺激小鼠脾脏细胞后引起的IL-4含量的变化显示出Th2免疫应答的特点，和血吸虫感染小鼠后8周脾脏细胞因子的变化特点相同，同时血吸虫感染小鼠8周后的DC细胞中表达CD8a＋的细胞数也有一定的增加，FBPA蛋白刺激后的小鼠脾脏细胞中的DC细胞中表达CD8a＋的细胞数也呈相同幅度的增加。

综上所述，SjFBPA通过DC细胞介导在血吸虫感染后诱导的Th2免疫偏移中起到重要作用，对揭示虫体免疫逃避、宿主免疫耐受、免疫偏移、免疫病理以及疫苗“失能”的分子机制有重要的指导意义。

参考文献

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A novel research of Th2 imm une deviation induced by SjFBPA

Hu Yuanyuan1，Xu Yuanhong1，Shen Jilong2，etal
（1Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022；2Anhui Institute of Human and Animal Diseases，Hefei230032）

AbstractOb jectiveTo analyze the dynamics of IL-4，CD8a in spleen cells of mice infected with cercariae of Schistosoma japonicum or SjFBPA and investigate the relationship between SjFBPA and the Th2-dominant response．Methods10 mice were infected by cercariae and 10 mice were uninfected．8 weeks after infection，allmice were sacrificed．Spleen single cell suspension was prepared and analyzed by flowed cytometry．Analysis was performed on the IL-4，CD8a cells of spleen cells stained with anti FITC-CD4，PE-CD8a，APC-IL-4 monoclonal antibody．Resu ltsAt 8 weeks，the percentage of IL-4 and CD8a cells in infected with cercariae of Schistosoma japonicum mice was 24．5%and 7．65%，respectively，while the percentage of IL-4 and CD8a cells in uninfected mice was1．18% and 0．571%，indicating a gradual decline（P＜0．05）．The percentage of IL-4 and CD8a cells in infected with SjFBPA was 18．3%and 5．82%，the percentage of IL-4 and CD8a cells in uninfected mice was 0．91%and 0．086%，indicating a gradual decline（P＜0．05）．ConclusionThis study suggests that SjFBPA may have a potential value for the Th2 response．DC cells as presenting cells are involved in the immune response．

Key wordsSchistosoma japonicum；SjFBPA；Th2 response

中图分类号R 383．24

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1566-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：81171606）

作者单位：1安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥230022

作者简介：胡媛媛，女，硕士研究生；