1，25-二羟维生素D3对免疫性血小板减少症模型小鼠的治疗作用

顾　悦，刘莉侠，杨明珍，曾庆曙，黄震琪，吴　炜，安福润

1，25-二羟维生素D3对免疫性血小板减少症模型小鼠的治疗作用

顾悦，刘莉侠，杨明珍，曾庆曙，黄震琪，吴炜，安福润

摘要目的观察并分析1，25-二羟维生素D3对免疫性血小板减少症（ITP）模型小鼠的治疗作用。方法将44只BALB／c小鼠分为正常对照组、模型组和1，25-二羟维生素D3治疗组。模型组经腹腔给予豚鼠抗小鼠血小板血清（GPAPS），治疗组在模型组的基础上经尾静脉注射给予100 ng／d的1，25-二羟维生素D3，正常对照组均给予相同体积的生理盐水经腹腔及尾静脉注射给药。在每次给药后24 h记录体重并采血，测量血小板计数，评价出血倾向。2周后处死小鼠并解剖，取骨髓涂片，镜下计数巨核细胞。从多方面评估1，25-二羟维生素D3对模型小鼠的治疗作用。结果注射第10天开始，1，25-二羟维生素D3治疗组小鼠进食量开始明显增加，精神和反应逐渐恢复；体重、血小板数较模型组明显上升（P＜0．05）；出血倾向较模型组明显降低（P＜0．05）；产板巨核细胞数较模型组高，低于正常对照组，而巨核细胞数较模型组低，高于正常对照组，差异有统计学意义。结论1，25-二羟维生素D3对模型小鼠在一般情况的改善、体重及血小板数的上升、出血倾向的降低和促进骨髓血小板生成等方面表现出一定影响。

关键词免疫性血小板减少症；动物模型；1，25-二羟维生素D3

2015-07-28接收

杨明珍，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：yangmz89＠163．com．cn

1，25-二羟维生素D3［1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3］是维生素D的生物活性形式，近年来发现其既可以作为先天性和获得性免疫应答的调节剂，同时还参与多种免疫调节活动，并调控细胞增殖分化［1］。树突状细胞（dendritic cell，DC）是一种重要的抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）。相关实验证实，1，25-（OH）2D3不仅能抑制

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是自身免疫性疾病的一种，其发病原因之一系体内产生针对自身血小板的特异性抗体，导致其破坏增多，从而导致外周血血小板减少［3-4］。该研究通过静脉给予模型小鼠1，25-（OH）2D3，评估血小板变化并观察其治疗效果，为临床上应用其治疗ITP等自身免疫性疾病提供依据。

1　材料与方法

1．1主要试剂及仪器1，25-（OH）2D3、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂（美国Sigma公司），红细胞裂解液（Solarbio公司）。玻璃毛细管（上海辰谊科学仪器公司），倒置显微镜（日本 OLYMPUS公司），血细胞计数板（上海求精生化仪器公司），多孔离心机（北京京立公司），电子分析天平（上海精密科学仪器公司）。

1．2实验动物6～8周龄SPF级BALB／c小鼠44只，雌雄各半，18～22 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，饲养和实验均在本校SPF级动物实验室内进行，室温18～22℃，湿度35%～50%，分笼饲养，饮水和摄食自由；5月龄清洁级豚鼠6只，480～600 g，雌雄不限，饲养和实验均在清洁级动物实验室内进行。

1．3方法

1．3．1抗血清的制备制备抗原（即小鼠血小板）：用摘眼球取血法收集小鼠外周血至EDTA-Na2抗凝离心管，800 r／min离心6 min，将上层及两层交界处液体小心吸出，移入另一不含抗凝剂的试管中，轻轻摇匀后即得到富含血小板的血浆（plateletrich plasma，PRP）。洗涤3次后，加生理盐水调整血小板浓度为1×109～2×109／L。取最终得到的血小板，分别与等量完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂充分混合成油包水状。

制备豚鼠抗小鼠血小板血清（guinea pig antimouse platelet serum，GP-APS）：取与完全弗氏佐剂混合的抗原，于第0周注射豚鼠背部、腹股沟及后足掌的皮下，每次至少4点，每点至少1 ml。取与不完全弗氏佐剂混合的抗原，分别于第1、2、4周注射于豚鼠背部、腹股沟及后足掌皮下，每次至少4点。第5周用乙醚麻醉豚鼠后，从心脏取不抗凝全血，3 000 r／min离心10 min，将上清液移入干净的离心管，该上清液即为GP-APS，贮存于-20℃冰箱。

1．3．2实验血清稀释倍数的筛选取14只小鼠随机分为7组，每组2只。将 GP-APS按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32稀释，分别给予第1～6组小鼠，经腹腔注射200μl／只；第7组小鼠为正常对照组，腹腔注射等量的生理盐水。观察血小板下降幅度和持续下降时间，评估并选取合适的血清稀释倍数。

1．3．3动物分组与模型建立另取30只小鼠，将其随机分成3组：1，25-（OH）2D3治疗组、模型组和正常对照组，每组10只，雌雄各半。注射APS前均记为第0天，第1次注射APS当天记为第1天。1，25-（OH）2D3治疗组和模型组均分别于第1、3、5、7、11、13天依照100μl／20 g的容积质量比给予小鼠腹腔注射1∶4稀释的GP-APS，使小鼠的血小板慢性持续性减少；而正常对照组则在同一时间点腹腔注射等量的生理盐水。并于注射APS第4天开始，1，25-（OH）2D3治疗组每天予以尾静脉注射100 ng 1，25-（OH）2D3，模型组在同一时间点予以尾静脉注射等量的生理盐水。

1．3．4血小板计数、体重和出血倾向于第2、4、6、8、10、12、14天分别从小鼠眼眶后静脉丛取血20 μl，加入盛有980μl红细胞裂解液的枸橼酸纳抗凝的试管内，充分混匀后，使用血细胞计数板计量血小板数，同时用电子天平称重小鼠，观察并记录体重变化及有无出血点和出血倾向（评分标准：注射处及皮下出血点＜3个＋1、＞3个＋2、口鼻出血＋1）。

1．3．5骨髓涂片巨核细胞观察实验结束后处死小鼠，迅速剥离胸骨，取胸骨骨髓用20μl小牛血清混匀迅速涂片并风干，瑞氏染色后在光学显微镜下观察整张涂片，选择染色良好部位，分别计数每张涂片3 cm2的巨核细胞总数以及产板巨核细胞数。

1．4统计学处理实验数据采用SPSS 16．0统计软件进行分析，结果使用±s表示，计量资料选用方差分析，计算F值，组间两两比较选用LSD方法，计数资料使用X2检验，计算X2值。

2　结果

2.1GP-APS效价的评估结果显示所有稀释比例的APS均可以使小鼠血小板数有不同程度的降低（F＝21），降低程度与稀释倍数呈负相关，但是1 ∶16、1∶32两个浓度稀释的APS组小鼠血小板数下降时间最多只能维持24 h，后迅速恢复正常。而1∶8浓度稀释的APS亦无明显的抑制作用，小鼠血小板下降维持36 h，后逐渐恢复正常。综合各方面因素，可见1∶4稀释浓度最符合本实验需要，见图1。

2．2小鼠体重及一般情况变化小鼠造模前称重，3组之间体重无明显差异（P＞0．05），见表1。注射第4天起，模型组和1，25-（OH）2D3治疗组小鼠均出现轻微的脱毛（口鼻周围和背部多见）、皮下瘀点（腹部及尾巴等注射部位明显）。同时出现精神萎靡、反应迟钝、进食量减少、活动量降低且有颤抖和竖毛现象，体重稍减轻，相关症状随注射次数增加而逐渐加重。注射第10天起，1，25-（OH）2D3治疗组小鼠进食量开始明显增加，精神和反应逐渐恢复。正常对照组小鼠未出现类似症状，反应灵敏，活动进食及体重等均无明显变化。

注射第10天，模型组小鼠体重持续降低，而1，25-（OH）2D3治疗组小鼠体重呈现上升趋势；注射第14天，正常对照组小鼠体重较前稍有增加，模型组小鼠体重仍较低，1，25-（OH）2D3治疗组小鼠体重呈持续上升趋势。从注射第10天起，两组之间差异均有统计学意义（P＜0．05），见表1。

表1　1，25-（OH）2D3对小鼠体重的影响（g，n＝10，±s）

表1　1，25-（OH）2D3对小鼠体重的影响（g，n＝10，±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05；与模型组比较：▲P＜0．05

组别　　第0天　　第4天　　第8天　　第10天　　第14天23．08±1．08模型　22．12±1．20　21．92±1．17　21．84±1．16*　21．73±1．15*　21．71±1．17*1，25-（OH）2D3治疗　22．71±1．21　22．53±1．18　22．19±1．14*　22．51±1．12*▲　22．60±1．15正常对照　22．32±1．33　22．54±1．23　22．64±1．25　22．83±1．23*▲

2．3出血评分注射APS第4天，模型组及1，25-（OH）2D3治疗组小鼠均开始出现不同程度的皮下出血。主要的出血部位为腹部、注射处、尾巴及生殖器等处，还有少数小鼠出现口鼻出血。表2显示注射第10天，1，25-（OH）2D3治疗组较模型组出血评分低，差异有统计学意义（P＜0．05）；而注射第14天，1，25-（OH）2D3治疗组的出血评分仍明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0．05）。注射结束后，可见1，25-（OH）2D3治疗组小鼠皮下出血部位范围较前明显缩小、个数减少；而模型组皮下出血部位仍较多，少数可见新发出血部位；而正常对照组小鼠无皮下出血，亦无口鼻出血。

表2　1，25-（OH）2D3对小鼠出血倾向的影响（只，n＝10）

2.41，25-（OH）2D3对小鼠血小板数的影响注射前采集小鼠外周血，3组间血小板数无明显差异。注射第4天，模型组和1，25-（OH）2D3治疗组小鼠血小板计数出现明显下降；至注射第10天，模型组小鼠血小板数稳定在较低水平，1，25-（OH）2D3治疗组小鼠血小板计数有所回升；注射第14天，模型组小鼠血小板计数持续稳定在较低水平，1，25-（OH）2D3治疗组小鼠血小板较前继续回升，正常对照组小鼠血小板维持在正常水平，稍有波动。从注射第10天起，1，25-（OH）2D3治疗组较模型组差异有统计学意义（P＜0．05），见表3。

表3　1，25-（OH）2D3对小鼠血小板数的影响（×109／L，n＝10，±s）

表3　1，25-（OH）2D3对小鼠血小板数的影响（×109／L，n＝10，±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05；与模型组比较：▲P＜0．05

组别　　第0天　　第2天　　第4天　　第6天　　第8天　　第10天　　第12天　　第14天187．00　1 266．50±187．74　1 167．50±178．64模型　1 323．00±110．61　934．50±47．636　662．00±74．70*　637．00±73．02*　626．00±62．84*　637．00±66．30*　630．50±67．12*　634．00±64．07*1，25-（OH）2D3治疗 1 291．00±214．62　880．50±123．88　638．00±94．00*　690．00±85．95*　658．00±66．45*　690．00±74．30*▲729．00±73．23*▲785．00±84．66正常对照　1 161．50±173．40 1 279．00±158．76　1 161．50±161．13　1 277．50±171．75　1 271．50±169．31　1 177．00±*

2.51，25-（OH）2D3对小鼠巨核细胞及产板巨核细胞数的影响模型组小鼠的产板巨核细胞数较正常组明显下降，而巨核细胞数则明显升高，1，25-（OH）2D3治疗组小鼠产板巨核细胞数较模型组稍高，但仍低于正常对照组，而巨核细胞数则低于模型组，高于正常对照组，差异均有统计学意义（P＜0．01）。正常对照组小鼠的巨核和产板巨核细胞计数均在正常水平范围，且形态正常，见表4。

表4　1，25-（OH）2D3对小鼠巨核细胞及产板巨核细胞数的影响（个／片，n＝10，±s）

表4　1，25-（OH）2D3对小鼠巨核细胞及产板巨核细胞数的影响（个／片，n＝10，±s）

与1，25-（OH）2D3治疗组比较：*P＜0．05

组别　　骨髓产板巨核细胞数　　巨核细胞数正常对照　24．20±3．36*　70．10±3．38*模型　7．20±2．78*　136．50±3．81*1，25-（OH）2D3治疗15．50±7．71　100．13±28．26

3　讨论

ITP是一种外周血血小板数减少、血小板寿命缩短、血小板表面有抗体结合、骨髓巨核细胞代偿性增多而血小板生成障碍的获得性自身免疫性疾病，其发病机制迄今虽然尚未完全阐明，但目前多认为既有体液免疫的紊乱，也有细胞免疫的失调［5-6］，其中DC细胞为专职的抗原提呈细胞，是各种免疫应答发生的启动、调控和维持的中心环节。既往国内外研究［7］表明，ITP患者外周DC细胞功能出现异常：一方面，DC细胞表面分子的过多表达或受体的表达缺陷，都可促使T细胞亚群功能失常和比例失调，而引起强烈的自身免疫反应；另一方面，DC细胞可以通过分泌B细胞活化因子（BAFF）、TNF家族因子增殖诱导配体（APRIL）等促进B细胞生存和分化成熟，从而直接促进B细胞分泌自身抗体。这些均表明DC细胞在ITP等自身免疫疾病的发病机制中有重要的作用。

前期实验结果证实，在体外使用生理剂量1，25-（OH）2D3处理体外扩增小鼠骨髓来源DC后，可以得到共刺激分子表达水平明显降低、激活T细胞能力减弱的耐受性未成熟DC，从而可以诱导免疫耐受［2］。

本研究通过给予小鼠GP-APS模拟ITP发病机制中的抗体破坏血小板这一过程，建立被动性小鼠ITP模型。在注射第3天即可见模型组和1，25-（OH）2D3治疗组血小板明显下降，并可见皮下出血，甚至口鼻出血，之后血小板一直稳定在较低水平；而注射第14天后处死小鼠，取骨髓涂片计数巨核细胞数示代偿性增多，其中产板巨核细胞数则明显降低，均符合ITP表现，表明该模型建立成功。在此模型基础上，从注射血清第4天开始给予1，25-（OH）2D3治疗，发现注射第8天，治疗组小鼠血小板在降至最低后开始上升，但差异无统计学意义。上升趋势从注射第10天开始明显，并一直呈持续上升状态，同时伴有出血评分下降。这些结果都证明了1，25-（OH）2D3针对ITP等自身免疫疾病具有一定的治疗作用，虽然治疗效果在第10天才具有明显差异性，表明其发挥作用需要一定时间。

近几年来，已有较多相关实验证实，1，25-（OH）2D3作为免疫调节剂可以改变不同免疫细胞的作用，调整单核细胞的细胞因子外形结构，促使原始T淋巴细胞向调节T细胞转化，还可以干扰DC细胞的分化和成熟［8-10］，将其锁定在半成熟的状态［11］，这种转变后的DC细胞共刺激分子表达水平降低。它还可以抑制白介素-12的分泌［12-13］，从而可以改变T淋巴细胞的免疫功能，诱导T细胞的无反应性，提高凋亡水平［10，14］。同时将T细胞的细胞因子应答反应，从与Th 1和Th 17共同作用的促炎反应，转换为与Th 2和调节性T细胞共同作用的更有耐受性的反应，从而诱导免疫耐受性［15-17］。笔者考虑1，25-（OH）2D3可能通过以上各种免疫调节作用诱导DC细胞的耐受性，从而发挥对ITP的治疗作用。下一步实验即可收集模型组及1，25-（OH）2D3治疗组小鼠的骨髓来源DC细胞，体外培养后，通过流式细胞术等技术测量DC细胞表面共刺激分子等表达水平，验证是否具有免疫耐受性。

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AbstractObjectiveTo observe and analyze the therapeutic effect of 1，25-dihydroxyvitamin D3on the immune thrombocytopenia（ITP）model inmice．Methods44 BALB／cmicewere divided into three groups：normal control group，model group and 1，25-dihydroxyvitamin D3treatmentgroup．Themodelgroup was given the GP-APS intraperitoneally，while the treatment group，on the basis of themodel group，was administered 100 ng／d of 1，25-dihydroxyvitamin D3by intravenous injection，and the normal control group was given the same volume of saline through both intraperitoneal and intravenous injection．The mice were taken blood samples after 24 hours of each administration，recorded their weights andmeasured platelet accounts and bleeding tendencies．After two weeks of injection，themice were sacrificed and dissected，smeared with the bonemarrow thathad been taken out，counted the number ofmegakaryocyte under themicroscope．Assessed the therapeutic effectof1，25-dihydroxyvitamin D3on themodelmice in several aspects．ResultsFrom the 10th day of the injection，the food-intake of the treatment group wasmarkedly increased，the spirit status and reaction was gradually recovered；the body weight and platelet account，compared with themodel group，were both significantly increased（P＜0．05）；bleeding tendency evident wasmarkedly decreased（P＜0．05）；the number of the platelet-formingmegakaryocyte was higher than themodel group and lower than the normal control group，while the number of the megakaryocyte was lower than the model group and higher than the normal control group，the difference was statistically significant．Conclusion1，25-dihydroxyvitamin D3shows some influence on the improvementof general status，the rise of body weight and platelet account，the reduction of bleeding tendency and the promotion of platelet＇s production of themodelmice．

Key wordsimmune thrombocytopenia；animalmodel；1，25-dihydroxyvitamin D3

Effect and mechanism ofm iRNA-4465 overexpression in them igration and invasion of breast cancer MDA-MB-231 cells

Luo Guangtao，Wang Benzhong
（Dept of Breast Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate the effect of overexpression of miRNA-4465 on invasion and metastasis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism．MethodsMiRNA-4465 minics was transfected into the MDA-MB-231 cells，and real-time PCR was used to detect the expression ofmiRNA-4465．Transwell assay was used to investigate themigration and invasion capability of cells after being transfected．Bioinformatics analysiswere performed to predict the potential targets ofmiRNA-4465，and finally，luciferase reporter plasmids assay and western blotwas used to confirm the potential target ofmiRNA-4465．Resu ltsComparing with negative control group，the expression ofmiRNA-4465 inmiRNA-4465minics group was increased significantly．Transwellmigration assay showed thatmigration capability of cells in miRNA-4465 minics group was decreased（P＝0．001）；transwell invasion assay showed that invasion capability of cells inmiRNA-4465 minics group was decreased（P＝0．010）．Luciferase reporter plasmids assay showed that comparing with the negative control＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（wild type），the fluorescence activity ofmiRNA-4465 minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（wild type）was decreased by 66%（P＝0．001）．Moreover，comparing with the negative control group，the expression of EZH2 protein was decreased after transfecting miRNA-4465 minics into MDA-MB-231 cells．ConclusionMiRNA-4465 can suppress the invasion and metastasis of breast cancer MDA-MB-231 cells，whichmay be related to the regulation of EZH2．

Key wordsmiRNA-4465；EZH2；breast cancer；metastasis人外周血来源DC的成熟和分化，对小鼠骨髓来源DC也有着类似作用［2］。

The therapeutic effect of 1，25-dihydroxyvitam in D3on ITP m icemodel

Gu Yue，Liu Lixia，Yang Mingzhen，et al
（Dept of Hematology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

中图分类号R 558＋．2

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1574-05

基金项目：安徽省自然科学基金（编号：1208085MH154）

作者单位：安徽医科大学第一附属医院血液科，合肥230022

作者简介：顾悦，女，硕士研究生；