N-乙酰半胱氨酸对香烟暴露小鼠肺组织中IL-17A及IL-22的影响

冯　迪，郭　欣，梅晓冬

N-乙酰半胱氨酸对香烟暴露小鼠肺组织中IL-17A及IL-22的影响

冯迪，郭欣，梅晓冬

摘要目的探讨香烟暴露诱导的肺气肿小鼠肺组织中白介素-17A（IL-17A）以及白介素-22（IL-22）的变化以及戒烟、N-乙酰半胱氨酸（NAC）对IL-17A和IL-22的影响。方法采用香烟暴露法建立小鼠肺气肿模型，给予戒烟及NAC灌胃干预。采用ELISA法检测肺匀浆及肺泡灌洗液（BALF）中IL-17A和IL-22浓度。HE染色观察肺组织病理学变化。结果香烟暴露可使小鼠肺组织发生肺气肿样变化。与正常对照组相比，肺匀浆及BALF中，香烟暴露后IL-17A及IL-22水平升高（P＜0．05）。与香烟暴露组比较，戒烟及NAC灌胃后IL-17A及IL-22水平下降（P＜0．05）。肺匀浆及BALF中IL-22与IL-17A的比值逐渐降低。结论IL-17A及IL-22与香烟暴露导致的小鼠肺组织中慢性炎症的发生有关。戒烟及NAC处理对吸烟导致的IL-17A及IL-22变化有一定干预作用。

关键词香烟暴露；N-乙酰半胱氨酸；白介素-17A；白介素-22

2015-08-10接收

梅晓冬，男，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：hfmxd＠sina．com

慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）是一组以不完全可逆气流受限为特征的疾病，主要病理变化包括慢性气道炎症和肺气肿。影响慢阻肺发生发展的因素十分复杂，与颗粒物质吸入、遗传基因、性别、社会经济状况等因素均有关。吸烟是已知的慢阻肺发病的主要病因之一。近年来研究［1-4］表明白介素-17（interleukin-17，IL-17）和白介素-22（interleukin-22，IL-22）在慢阻肺的发病中起重要作用，是慢阻肺病理变化发生的重要细胞因子。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一种硫醇类抗氧化剂，具有抗炎、抗氧化应激等多种药理效应，其在治疗慢阻肺中的作用机制目前尚未完全阐明，在慢阻肺炎症免疫机制中发挥的调节作用也不清楚。临床研究［5］显示NAC对慢阻肺有一定治疗效果。该研究通过吸烟制作小鼠肺气肿模型，予以戒烟和使用NAC治疗，观察小鼠肺匀浆及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中IL-17A及IL-22的变化，探讨NAC对小鼠肺中IL-17A及IL-22相关机制的干预影响。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物健康雄性BABL／c小鼠，清洁级，10周龄，20～27 g，由安徽医科大学实验动物中心提供。在恒温（25°C），光照：黑暗周期12 h∶12 h环境中饲养适应1周后实验。本研究经安徽医科大学附属省立医院伦理委员会批准。

1．1．2药品与试剂红三环牌香烟（安徽红三环工业公司，焦油量为11 mg／支，烟碱量为0．8 mg／支，一氧化碳量为15 mg／支）；NAC（A7250，美国Sigma公司）；IL-17A、IL-22 ELISA试剂盒（产品批号：23017968、23023883，上海裕平公司）。

1．1．3仪器与设备自制香烟暴露带孔玻璃仓；JT12001电子天平（上海精天电子仪器厂）；KDC-2046低速冷冻离心机（中科中佳科学仪器有限公司）；高速匀浆器（合肥艾本森科学仪器有限公司）；恒温仪（上海卓一电子有限公司）；酶标仪（上海赛默飞世尔仪器有限公司）；BI2000生物医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1．2方法

1．2．1动物模型的建立将BABL／c小鼠按随机数字表法分为正常对照组、香烟暴露组、戒烟4周组、戒烟8周组、戒烟12周组、NAC灌胃4周组、NAC灌胃8周组、NAC灌胃12周组，每组5只。正常对照组不给予任何干预措施，自由摄食饮水。香烟暴露组、戒烟组及NAC灌胃组置香烟暴露玻璃仓内给予香烟烟雾暴露，同时点燃4支香烟，放入仓内自然燃烧，待燃烧完毕烟雾基本消失（约20 min）后，打开仓盖，休息30 min后重复上述操作3次。每周5 d，持续24周，肺气肿模型造模结束。将正常对照组及香烟暴露组小鼠处死采样。戒烟4周组停止香烟暴露，继续饲养4周后处死采样。戒烟8周组继续饲养8周处死采样，戒烟12周组继续饲养12周处死采样，饲养方法同正常对照组。NAC灌胃4周组停止香烟暴露，并给予NAC 100 mg／kg灌胃，每天1次，每周5 d，4周后处死采样。NAC灌胃8周组8周后处死采样，NAC灌胃12周组12周后处死采样。

1．2．2标本采集小鼠最后一次香烟暴露或者给药24 h后，给予硫喷妥钠腹腔注射麻醉，立即解剖暴露气管，取出右肺，置入10%甲醛内固定，留作病理观察。左肺行气管插管后予以冷0．9%盐水以0．4、0．3、0．3 ml分3次气管内灌入，每次反复抽吸3次后回收，回收率60%～70%。回收后的 BALF 在4°C条件下，3 000 r／min离心10 min，取上清液分装后置-80℃冰箱保存备用。离断灌洗后的左肺，称取重量，按1∶5的量，加冷生理盐水，冰上充分研磨，成浆后4℃、3 000 r／min离心10 min，取上清液分装置-80℃保存备用。

1．2．3病理切片制作将固定好的肺组织石蜡包埋切片，行HE染色，每只小鼠制作3张切片，每个切片任取5个视野，光学显微镜下（10×10）观察肺组织结构的形态学变化，参照文献［6-7］测量平均肺泡壁内衬间隔（linear intercept，Lm）及损伤指数（destructive index，DI）并进行统计学分析。

1．2．4ELISA法检测IL-17A、IL-22浓度按照ELISA试剂盒提供的使用说明书检测BALF及肺匀浆中IL-17A、IL-22的浓度。

1．3统计学处理采用SPSS 16．0统计软件进行分析，数据以±s表示，多组间两两比较采用单因素方差分析及两两比较的SNK法。采用Graphpad Prism 5软件作图。

2　结果

2．1形态学变化光镜下，正常对照组小鼠肺泡壁完整、连续、肺泡大小较均一。各实验组（香烟暴露组、戒烟组及NAC灌胃组）小鼠肺泡壁显著变薄、断裂，肺泡腔扩大、大小不一，肺泡Lm、DI明显高于正常对照组，差异有统计学意义（F＝2．94、3．60，P＜0．05），各实验组之间差异无统计学意义，见表1。

表1　各组小鼠平均肺泡　Lm及　DI比较（±s）

表1　各组小鼠平均肺泡　Lm及　DI比较（±s）

与正常对照组比较：*P＜0．05

组别　Lm（μm）DI正常对照30．25±4．11　29．25±5．50香烟暴露　48．60±7．60*　47．80±8．14*戒烟　4周　45．25±5．80*　52．50±9．33*戒烟　8周　45．25±9．67*　52．00±6．58*戒烟12周　41．40±5．86*　46．60±6．19*NAC 4周　45．40±5．86*　49．40±8．71*NAC 8周　43．60±8．02*　46．40±9．29*NAC12周　46．40±5．64*　46．00±6．86*

2.2肺匀浆及 BALF中 IL-17A的变化与正常对照组比较，香烟暴露后小鼠肺匀浆中IL-17A水平显著升高；戒烟4周后IL-17A水平虽有下降趋势，但差异无统计学意义。戒烟8周、12周、NAC灌胃各组IL-17A水平与香烟暴露组相比，均明显下降（P＜0．05），与正常对照组比较差异无统计学意义。与戒烟4周相比，NAC灌胃4周组IL-17A水平明显下降，见图1A。与正常对照组比较，香烟暴露后，小鼠BALF中IL-17A水平明显升高。同样，戒烟4周对升高的IL-17A无显著影响。戒烟8周及NAC灌胃4、8周组IL-17A水平仍高于正常对照组。戒烟12周及NAC灌胃12周后IL-17A浓度降至正常对照组水平。与戒烟4周相比，NAC灌胃 4周组IL-17A水平明显下降，见图1B。

2.3肺匀浆及BALF中IL-22的变化香烟暴露后小鼠肺匀浆中IL-22水平明显升高。戒烟4、8周后，IL-22水平有所下降，但差异无统计学意义。与香烟暴露组比较，戒烟12周及NAC灌胃各组IL-22值均显著降低；此4组与正常对照组比较差异均无统计学意义。与戒烟4周相比，NAC灌胃4周组IL-22水平明显下降，见图2A。BALF中，香烟暴露组、戒烟各组及NAC灌胃4、8周组IL-22水平较正常对照组均升高，仅NAC灌胃12周组IL-22水平下降至正常对照组水平。除戒烟4周组外，其余各处理组IL-22水平均较香烟暴露组降低。与戒烟4周相比，NAC灌胃4周组IL-22水平明显下降，见图2B。

2.4肺匀浆及BALF中IL-22与IL-17A比值的变化肺匀浆及BALF中，随着戒烟及NAC灌胃干预时间的延长，IL-22与IL-17A的比值不断下降，见图3。

3　讨论

IL-17家族包括IL-17A～F、IL-21、IL-22，目前研究最多的主要为IL-17A和IL-22。多种免疫细胞可分泌IL-17和IL-22，其中Th17是IL-17及IL-22的主要来源细胞［8-9］。此外，Th22亦可分泌大量IL-22［10］。近年研究［11-12］表明IL-17和IL-22增高与多种慢性炎症疾病如类风湿、系统性红斑狼疮、银屑病发病有关。抗-IL-17和抗-IL-22抗体治疗能够在一定程度上改善病情，提示IL-17、IL-22可促进这些自身免疫性疾病的发生。

IL-17及IL-22是慢阻肺发生发展的关键细胞因子。本研究显示香烟暴露后，小鼠肺匀浆及BALF中IL-17A浓度升高，与蒙菁菁等［3］的报道一致。小鼠受到香烟烟雾刺激后，Th17等多种炎症细胞募集于气道，产生各种细胞因子，这可能是IL-17A增加的直接原因。随着戒烟时间的延长，气道受到的烟雾刺激逐渐减少，募集的炎症细胞亦逐渐减少，因而IL-17A等细胞因子的分泌逐渐减少。与Li et al［4］的研究结果类似，本实验香烟暴露后，小鼠BALF中IL-22升高。同样，这与Th17、Th22细胞浸润气道，导致IL-22分泌增多有着密切关系。戒烟4周、8周、12周后，炎症细胞浸润渐减少，继之产生的IL-22亦逐渐减少。

NAC是一种含有巯基（-SH）的还原性物质，为还原性谷胱甘肽的前体。除抗氧化作用外，NAC还有一定的抗炎作用。临床研究［13］显示口服NAC能够显著提高慢阻肺患者的用力呼吸流速，减少慢阻肺急性加重及患者住院的次数。本实验中，NAC灌胃后小鼠肺组织中升高的IL-17A、IL-22水平明显降低，可能与NAC抑制氧化应激反应、气道炎症得以控制有关。值得注意的是，随着给药时间延长，IL-17A、IL-22水平有逐渐下降的趋势；与同期戒烟组比较，NAC灌胃各组IL-17A、IL-22水平均低于戒烟组，即戒烟同时予以 NAC治疗，就减少炎症因子而言，其疗效优于单纯戒烟。

IL-17和IL-22不仅来源细胞相似，而且两者在多数免疫炎症反应中呈现同增同减的趋势［14］。本实验显示，香烟暴露后小鼠肺组织中IL-17A和IL-22表达均明显增加，戒烟及NAC灌胃后二者均又明显减少。随着香烟暴露、戒烟和NAC干预时间的增加，肺匀浆和BALF中，IL-22及IL-17A浓度变化程度不同，两者比例逐渐减小。提示IL-17A与IL-22这两种细胞因子在吸烟导致慢性肺部炎症的发病机制中，不同阶段作用可能有所不同。据此推测这与IL-17A抑制Th17细胞产生IL-22，从而使两者比值减少有关［15］。此现象的意义及两者之间相互影响的确切机制尚需进一步研究。

综上所述，本研究显示IL-17A和IL-22参与吸烟导致的肺部炎症的发生。戒烟能够使烟熏小鼠的慢性气道炎症明显减轻，增高的IL-17A和IL-22显著降低，但不能完全恢复至正常水平。NAC能够明显减轻吸烟导致的气道炎症，进一步改善戒烟后小鼠肺部的炎症变化。IL-17A和IL-22相关的免疫在慢阻肺的发病机制中的作用值得深入研究。

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Changes of interleukin-17A and interleukin-22 in the lung of cigarette smoke exposed m ice and the effect of N-acetylcysteine

Feng Di，Guo Xin，Mei Xiaodong

AbstractObjectiveTo investigate the changes of interleukin-17A（IL-17A）and interleukin-22（IL-22）in the lung of cigarette smoke exposedmice and the effectof smoking cessation and N-acetylcysteine（NAC）treatment．MethodsBALB／c mice in experimental groups were exposed to cigarette smoke．Then the smoke-exposure was stopped andmicewere treated with NAC gavage．Themicewere executed 1，2，and 3 months after smoking cessation．Lung tissue sample and bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were collected．HE staining was used to observe the pathologic changes of the lung and ELISA was used tomeasure the level of IL-17A and IL-22．Resu ltsConsiderable emphysematous changes was found in the lung ofmice exposed to cigarette smoke．Compared with the controls，the level of IL-17A and IL-22 elevated remarkably in pulmonary tissue and BALF after smoking exposure and declined gradually after smoking cessation．Additional NAC gavage treatment enhanced the decline tendency．ConclusionIL-17A and IL-22 might play a complex role in the chronic inflammatory changes of lung in mice exposed to cigarette smoke．

Key wordscigarette smoking；N-acetylcysteine；interleukin-17A；interleukin-22

中图分类号R 563．3

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1579-05

基金项目：安徽省自然科学基金（编号：1308085MH115）

作者单位：安徽医科大学附属省立医院呼吸内科，合肥230001

作者简介：冯迪，女，硕士研究生；