硫利达嗪增强伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞K562的抑制作用及机制

牛　伶，夏雷鸣，刘　柳，李　坦，李　斌，鲍扬漪，刘　欣

硫利达嗪增强伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞K562的抑制作用及机制

牛伶1，夏雷鸣1，刘柳1，李坦1，李斌1，鲍扬漪1，刘欣2

摘要目的观察硫利达嗪（THZ）、伊马替尼（IM）单药及联合对人慢性粒细胞白血病（CML）细胞K562的诱导作用，并探讨其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定THZ、IM单药及联合对细胞的抑制作用，计算两药协同指数（CI）。检测THZ、IM单药及联合对细胞凋亡的影响。Western blot法检测凋亡蛋白Cleaved-Bid、Procaspase 3，凋亡调节蛋白Bcl-2、Bax、pPI3K、pAKT表达的变化。结果THZ 16 μmol／L作用24 h后K562细胞增殖明显抑制，低剂量细胞毒性作用不明显。IM低剂量即有较强的细胞毒性作用，两药联合后经计算有较好的协同作用。根据CI值选定药物浓度作用K562细胞24 h，流式细胞术结果显示，THZ单药组无明显细胞凋亡，IM单药组、IM联合THZ组均存在不同程度的细胞凋亡，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。Western blot法结果显示各实验组细胞胞内Cleaved-Bid表达量增加，Procaspase 3表达量下降。抗凋亡蛋白Bcl-2、pPI3K、pAKT下调、促凋亡蛋白Bax表达明显上调，各实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。结论低剂量THZ联合IM对CML细胞K562具有显著的增殖抑制作用，其作用较IM单用作用强，THZ有明确增敏IM的作用。与IM、THZ单药组比较，IM联合THZ组Cleaved Bid表达量上调、Procaspase 3表达量下降，其杀伤机制可能与线粒体通路及抑制PI3K-AKT通路均有关。

关键词慢性粒细胞白血病；硫利达嗪；伊马替尼；细胞凋亡；凋亡蛋白；凋亡调节蛋白

2015-07-01接收

液肿瘤科，合肥230061

2安徽省立医院血液内科，合肥230001

鲍扬漪，女，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：761760565＠qq．com

慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一种常见恶性血液系统肿瘤。伊马替尼（imatinib，IM）作为CML治疗的一线方案，其疗效已得到广泛认可［1］，分子缓解率（molecular remission，MR）达到90%以上［2］，持续治疗可使大多数患者长期维持在慢性期，生存期大大延长。80%以上的患者可以存活8年，年死亡率低于2%［3］。但随着IM治疗经验的积累，其局限性也被广泛报道。首先，IM不能清除患者体内的白血病干细胞（leukimia stem cells，LSCs），目前认为LSCs是CML复发的根源［4］。其次，未获得完全分子学缓解（complete molecular remission，CMR）的患者在停药后出现复发的比例可能超过60%，甚至达到100%［5］。目前大量IM耐药病例被报道，但是具体机制目前尚不明确［6］。寻找与IM有协同作用的药物，发挥更好的治疗效果成为新方向。多巴胺受体抑制剂硫利达嗪（thioridazine，THZ）被广泛用于治疗精神类疾病和抗耐药结核菌感染。近来THZ抗多种恶性肿瘤方面的作用被大量报道［7-8］。该研究旨在观察THZ、IM对CML-K562细胞的效应，并对两药协同在凋亡中的作用进行初步探讨。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1主要仪器FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；680全自动酶标仪（美国BIO-RAD公司）；8000DH型二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）；CKX41型倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1．1．2实验药物与细胞株THZ（美国Gibco公司），IM（英国Kinasechem公司），K562细胞株由安徽医科大学第三附属医院血液肿瘤科实验室传代保存。

1．1．3主要试剂1640培养基、青霉素-链霉素双抗、二甲基亚砜（DMSO）、胎牛血清（美国Gibco公司）；流式抗体Annexin V-FICT／PI双染细胞凋亡检测试剂盒；四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测试剂盒（美国Sigma公司）；小鼠抗人Cleaved-Bid、Procaspase 3、Bcl-2、Bax、pPI3K、pAKT单克隆抗体（美国Abcam公司）。

1．2方法

1．2．1K562细胞培养细胞株培养于10%灭活胎牛血清的1640培养液中，置于饱和湿度、5% CO2、37℃的恒温培养箱中。实验前细胞培养2周。

1．2．2THZ、IM单药和联合 K562细胞株细胞光镜、细胞活性率、细胞凋亡细胞光镜：取对数生长期CML细胞，1 000 r／min离心5 min，重复2次，调整细胞数量为4×104个／m l，100μl／孔种至96孔板，对照组和THZ单药组、IM单药组、IM联合 THZ组均设3个复孔，37℃孵育过夜。实验组设计如下：THZ取0、2、4、8、16μmol／L加入THZ单药组、IM取0、0．1、1、10、100μmol／L加入IM单药组，16 μmol／L THZ联合0、0．1、1、10、100μmol／L IM作为联合用药组，对照组加入培养基，分别培养0、24、48 h，倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

细胞抑制率：每孔加入10μl MTT（5 g／L），避光孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入100μl DMSO，室温振荡10 min，以酶标仪在490 nm双波长检测相应的吸光度（absorbance，A），细胞抑制率（%）＝死细胞总数／（活细胞总数＋死细胞总数）×100%。实验重复3次。

细胞凋亡：取对数生长期K562细胞，调整细胞数量至3×104个／m l，每孔2ml种于6孔板，实验组3孔，对照组1孔。THZ、IM分别以2μmol／L、1 μmol／L及联合加入实验组孔，对照组换液不加药，收集细胞（包括上清液中细胞），预冷的PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×106／ml，取60μl悬液加入流式管中，以10μl Annexin V-FITC和5μl PI标记，震荡混匀后室温避光孵育15 min，PBS洗涤2遍后加入400μl流式鞘液，以流式细胞术检测细胞凋亡程度。Annexin V-FITC和PI标记的细胞即为凋亡细胞。细胞凋亡率（%）＝凋亡细胞数／总细胞数× 100%。实验重复3次。

1．2．3THZ、IM联合PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白Western blot分析取对数生长期细胞，调整细胞数目3×104个／m l培养于6孔板中，每孔2 m l，实验组3孔，对照组1孔。37℃孵育过夜，THZ、IM分别以2μmol／L、1μmol／L及联合加入实验组孔，培养24 h，PBS洗涤2遍，收集细胞。蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r／min离心30 min提取总蛋白。BCA法蛋白定量后加入5×Loading Buffer，100℃变性15 min，12%SDS-PAGE凝胶电泳，按照30 μg／孔上样，12%SDS-PAGE凝胶电泳，恒压80 V电泳至分离胶，恒压120 V至电泳结束，电转印至PVDF膜上（220 mA、120 min），TBST配制5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入小鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、小鼠抗Bax（1∶1 000）、小鼠抗pPI3K（1∶1 000）、小鼠抗pAKT（1∶1 000）一抗室温孵育1 h，TBST冲洗3次，每次10 min，辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST冲洗3次，每次10 min，ECL显影，暗室曝光成像。

1．3统计学处理采用SPSS 13．0统计软件进行分析，计数资料以±s表示，所有数据均重复3次取中位数为实验数据，采用CompuSyn软件计算药物协同指数（combinationindex，CI），CI＜1为具有协同效应。组间比较采用单因素方差分析及SNK-q检验。

2　结果

2.1IM、THZ单药及联合对K 562细胞凋亡的影响MTT实验结果显示：2、4、8μmol／L THZ对K562细胞影响小，药物作用24 h后抑制率（%）分别为6±5、7±2、9±5，16μmol／L THZ处理K562细胞24 h的抑制率（%）约为65±2，处理48 h后抑制率（%）为97±1．5；0．1、1、10和100μmol／L IM对K562细胞抑制率均有明显影响，0．1、1、10、100 μmol／L IM处理K562细胞24 h的抑制率（%）分别为50±12、70±11、74±14、85±11；16μmol／L THZ联合不同浓度的IM对K562细胞均有明显的抑制作用。THZ单药16μmol／L作用24、48 h与对照组比较差异均有统计学意义（F＝170．008，F＝471．222；P＜0．01）。IM单药各种浓度作用24、48 h与对照组比较差异均有统计学意义（F＝24．906，F ＝26．983；P＜0．01）。IM联合 THZ中16μmol／L THZ＋1μmol／L IM、16μmol／L THZ＋10μmol／L IM两组作用24、48 h与对照组比较差异均有统计学意义（F＝9．025，F＝5．429；P＜0．01）。见图1。THZ、IM单加及联合作用K562细胞24 h的杀伤效应，经CompuSyn软件计算两者的CI，结果显示两者具有良好的协同效应。见表1、图2。根据CI值，选定2 μmol／L THZ和1μmol／L IM进行单药联合实验，药物作用24 h。细胞光镜（×200）下观察，THZ、IM单药及联合作用24 h后，对照组细胞轮廓明确、清楚，生长旺盛，而随着药物浓度的增加，细胞明显轮廓不清、体积缩小、边缘透亮、间隙增加。见图3。流式细胞仪结果显示，2μmol／L THZ、1μmol／L IM及联合作用24 h后K562的抑制率（%）分别为12．4± 5．7、71．75±4．9、87．31±6．4。IM联合THZ组与IM单药、THZ单药组比较，差异有统计学意义（F＝192．4，P＜0．01）。见图4。

2.2IM联合THZ作用K562细胞株凋亡相关蛋白表达变化凋亡蛋白Cleaved-Bid、Procaspase-3活性检测结果显示，药物作用24h后，不同药物组

K562的Cleaved-Bid、Procaspase-3表达水平较对照组出现差异，THZ组较对照组Cleaved-Bid表达升高、Procaspase 3表达下降，IM单药、IM联合THZ组变化更明显。方差分析 F值，Cleaved-Bid：F＝16．515，Procaspase 3：F＝62．859。组间差异均有统计学意义（P＜0．01）。见图5。凋亡调节蛋白在不同药物组中药物作用24 h后，Western blot检测结果显示，各实验组线粒体通路抗凋亡蛋白Bcl-2下调、促凋亡蛋白Bax表达明显上调，PI3K-AKT通路中，pPI3K、pAKT各实验组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0．01）。见图6。 ?

表1　THZ、IM单药和联合作用K 562细胞24 h的毒性效应值及对应CI

3　讨论

Druker etal［1］指出在 IM一期试验中，接受IM治疗4周后54例患者中有53例获得完全的血液学反应（complete hematologic responses，CHR），IM治疗超过一年的患者96%为CHR。Kantarjian et al［9］在二期试验中，532例每天接受400 mg IM治疗的患者在中位随访时间18个月内，95%获得CMR，89%疾病未进展。但临床上耐药以及严重不良反应的发生越来越多［10］，且现主流观点认为IM并不能清除骨髓中CML-LSCs，而其是导致疾病复发的根源［4］。寻找新的能够作用于CML-LSCs的药物成为CML治疗的新方向。目前THZ的杀伤作用研究较多，该药可作用于广泛类别的肿瘤，特别是对肿瘤干细胞有杀伤作用，但不会影响正常干细胞［11］。THZ杀伤肿瘤细胞的机制尚未完全明确，多条与凋亡有关的通路可能与该机制有关［12］。线粒体凋亡途径是凋亡的重要途径，激活后线粒体膜通透性增高导致细胞凋亡。其中Bcl-2超家族蛋白关键因子，Bcl-2家族中的Mcl-1是抗凋亡蛋白，可维持线粒体膜的稳定性，Bax是促凋亡蛋白，正常时Bax和 Bcl-2可形成异源二聚体共同维持线粒体膜稳定性，出现病理变化时Bax-Bcl-2二聚体解离，Bax同源二聚体增多，形成膜孔道，改变线粒体膜电位，促凋亡因子被释放到细胞质中，导致细胞凋亡。PI3K-AKT通路诱导细胞的增殖、分化，避免细胞发生凋亡，此信号通路作为细胞生长增殖的重要转导通路，在维持细胞恶性生物学特性中起重要作用［13］。

本研究显示，低剂量THZ对 K562细胞无明显抑制作用，IM单药细胞毒性作用较强，Compusyn软件分析CI显示低剂量THZ联合低剂量IM有良好的协同作用。关于低剂量THZ和IM作用K562细胞凋亡作用，实验中以Cleaved-Bid、Procaspase 3蛋白加以验证：低剂量THZ作用于 K562细胞24 h后Cleaved-Bid、Procaspase 3蛋白表达无明显变化，低剂量IM、低剂量IM联合THZ作用K562细胞24 h后Cleaved-Bid、Procaspase 3表达量均有变化，但联合后Cleaved-Bid、Procaspase 3蛋白表达量变化更明显。本研究进一步分析了THZ、IM单药及联合作用于K562细胞的线粒体、PI3K-AKT凋亡通路调节蛋白的表达量以期分析其可能的作用机制。结果显示低剂量IM单药及低剂量IM联合THZ在两条通路中均起作用，两条通路凋亡相关蛋白均上调，抑凋亡相关蛋白均下调。

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Inhibition and m echanism of im atinib for chronic m yeloid leukem ia enhanced by thioridazine

Niu Ling1，Xia Leiming1，Liu Liu2，et al
（1Dept of Hematology and Oncology，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230061；2Dept of Hematology，Anhui Provincial Hospital，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo study the effects of thioridazine（THZ）and imatinib（IM）on chronicmyeloid leukemia （CML）cells（K562 cells）．MethodsThe K562 cellswere treated by different concentrations of IM（0，0．1，1，10 and 100μmol／L）and THZ（0，2，4，8 and 16μmol／L）for24 and 48 h．The effects ofeach drug on the inhibition of cellswere examined by the MTT assay．Then K562 cellswere treated by different concentrations of IM（2，4，8 and 16μmol／L）and THZ（0．1，1 and 10μmol／L）for24 h alone or in combination．The inhibition of cellswas examined by the MTT assay．The combinational index（CI）was calculated by the CompuSyn software．Next K562 cellswere treated by IM of 1μmol／L and THZ of 2μmol／L for 24 h alone or in combination．Apoptosiswas detected by the Annexin V／PI staining and flow cytometry．Apoptosis related proteins，pPI3K and pAKT were detected by theWestern blotting．ResultsResults of the MTT assay indicated thatbeing treated by THZ of low concentrations alone had no significant influence on the inhibition of K562 cells，while being treated by THZ of 16 μmol／L showed significant effect on inducing death of K562 cells．IM alone had effect on inducing death of K562 cells of a low concentration．K562 cells being treated by IM combined with THZ had a good synergistical effect on inducing death．Then K562 cellswere treated with selected drug concentration according to CIvalues for 24 h，it revealed that thioridazine group had no significant apoptosis effect by flow cytometry，while in imatinib group，twodrug combination group there had different degree of apoptosis effect，and the control group was statistically significant（P＜0．01）．Meanwhile，results of the Western blot showed that the increased expression of Cleaved Bid in each experimental group cells，while decreased expression of Procaspase 3．Up-regulation of anti apoptosis protein （Bcl-2，pPI3K and pAKT）expression and downregulation of apoptosis protein Bax expression demonstrated that the difference was statistically significant（P＜0．01）comparing each experimental groups with the control group．ConclusionIM plus THZ can synergistically induce caspase-independent apoptosis of K562 cells．The killing mechanism may be associated with themitochondrial pathway and inhibition of the PI3K-AKT pathway．

Key wordschronic myeloid leukemia；Thioridazine；Imatinib；apoptosis；apoptosis related proteins；apoptosis regulating protein；PI3K-AKT pathway

中图分类号R 737．9；R 971．41

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1597-06

基金项目：安徽省自然科学基金（编号：1508085MH195）

作者单位：1安徽医科大学第三附属医院（合肥市第一人民医院）血

作者简介：牛伶，女，副主任医师；