人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位

徐雪琴，潘林鑫，耿慧武，刘晓颖，范礼斌

Xu Xueqin，Pan Linxin，Geng Huiwu，et al（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei　230032）

人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位

徐雪琴，潘林鑫，耿慧武，刘晓颖，范礼斌

摘要目的运用基因克隆技术构建人源β1，4-半乳糖转移酶Ⅱ（β4GalTⅡ）真核表达质粒，并将其转染到COS7细胞中，观察蛋白在细胞内的定位，同时转染到HEK 293T细胞中检测其表达。方法分别设计带FLAG标签和GFP标签的β4GalTⅡ基因的特异性引物，以含人β4GalTⅡ全长cDNA序列为模板，定向构建到pcDNA3．1（＋）及pCDGFP真核表达载体中，构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组质粒，利用Lipofectamine 2000分别转染COS7、HEK 293T细胞，免疫荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的定位，Western blot法鉴定重组蛋白的表达。结果成功构建pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG和pCDGFP-β4GalTⅡ重组表达载体，定位实验表明：β4GalTⅡ-FLAG和GFP-β4GalTⅡ二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围，并有明显的块状染色，胞核中未见明显分布；Western blot法检测显示重组β4GalTⅡ蛋白在HEK 293T细胞中稳定表达。结论获得了人β4GalTⅡ的真核表达质粒，并能在COS7和HEK 293T细胞中表达，为进一步研究β4GalTⅡ的功能及其与其他蛋白的相互作用奠定了一定基础。

关键词β4GalTⅡ；转染；细胞定位；蛋白表达

2015-07-30接收

范礼斌，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn；

刘晓颖，女，副教授，责任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn

β1，4-半乳糖转移酶Ⅱ（β1，4-galactosyltransferaseⅡ，β4GalTⅡ）是β1，4-半乳糖转移酶家族的一员，Raquel利用EST数据库独立发现的，其与家族中首个被发现的β4GalTⅠ有高达55%的序列同源性，在胎脑中表达较高，在心脏、骨骼肌、胰腺、睾丸、前列腺、卵巢、小肠中也均有表达［1-3］。人β4GalTⅡ基因定位于1p34-p33，包含10个外显子，基因全长111 970 bp，mRNA全长2 209 bp，编码含372个氨基酸残基的约42 ku的β4GalTⅡ蛋白［1，4］。β4GalTⅡ与大多数的糖基转移酶有着相似的结构域，主要包括短的胞质区N-末端肽段、跨膜结构域以及催化结构域，其跨膜结构域可能对其在高尔基复合体上的定位是至关重要的［5］。该研究通过在pcDNA3．1（＋）载体及pCDGFP载体的多克隆位点插入β4GalTⅡ的cDNA片段，分别构建了带FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG和带GFP标签的真核表达质粒pCDGFP-β4GalTⅡ，并将其转染进COS7和HEK 293T细胞中，初步观察β4GalTⅡ在哺乳动物细胞内的定位及表达情况，为后续探究该蛋白的生物学功能提供理论依据。

1　材料与方法

1．1材料

1．1质粒、菌株与细胞含人β4GalTⅡ全长cDNA序列的模板由安徽医科大学李俊教授提供；质粒pcDNA3．1（＋）购自Invitrogen公司；pCDGFP质粒、TG1菌株、COS7及HEK 293T细胞株均由安徽医科大学生物实验室保存。

1．2主要试剂PCR引物合成和测序均由上海英潍捷基生物工程有限公司完成；PrimerSTARⓇHS DNA Polymerase购自TaKaRa公司；EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ限制性核酸内切酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶及Lambda DNA Marker购自Fermentas公司；DNA胶回收试剂盒和质粒小量抽提试剂盒购自Axygen公司；蛋白Marker购自BioRad公司；DMEM完全培养基、胎牛血清分别购自Hyclone公司和Gibco公司；转染试剂Lipofectamine 2000、Opti-MEM购自Invitrogen公司；细胞裂解液和一抗稀释液购自上海碧云天公司；Flag一抗购自Sigma公司；GFP一抗购自Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG与罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司；荧光封片胶购自Dako公司；显色试剂盒购自Pierce公司；其他试剂均为国产分析纯或符合实验要求。

1．3方法

1．3．1质粒构建以含人β4GalTⅡ全长cDNA序列为模板，设计2对引物，使用PrimerSTARⓇHS DNA Polymerase进行PCR，分别扩增出β4GalTⅡ-FLAG和β4GalTⅡ，引物序列见表1。将PCR所得产物用1．2%的琼脂糖凝胶电泳分离，按照胶回收试剂盒方法进行纯化回收。纯化回收的β4GalTⅡ-FLAG和pcDNA3．1（＋）载体分别用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切；纯化回收的β4GalTⅡ和pCDGFP载体分别用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切。酶切后的片段和载体经DNA凝胶纯化后分别连接，得到pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG和pCDGFP-β4GalTⅡ。重组质粒转化TG1感受态细胞，挑取单克隆进行液体震荡培养后抽提质粒，酶切鉴定正确的重组质粒送上海英潍捷基生物工程有限公司测序。测序结果登录NCBI与β4GalTⅡ序列作BLAST分析。

表1　引物序列

1．3．2细胞培养COS7细胞和HEK 293T细胞使用含10%胎牛血清、100 U／ml的青、链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中进行培养。当细胞铺满培养皿底部时传代。选用对数生长期细胞进行实验。

1．3．3细胞转染转染前24 h，用胰酶消化细胞，以1．0×106／cm2的密度接种于60 mm培养皿，用于免疫荧光实验的培养皿中预先放入经多聚赖氨酸包被的盖玻片，用无抗生素的完全培养基，37℃、5% CO2恒温培养至次日对数生长期，使细胞达到90%以上的汇合度（转染到COS7细胞中观察荧光定位的细胞汇合度只需要达到30%～40%的汇合度）。转染实验根据Lipofectamine 2000试剂说明书进行。转染后4～6 h换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。转染24 h后进行免疫荧光制片，用荧光显微镜观察蛋白的荧光定位或者48 h后收集细胞，从HEK 293T细胞中提取蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳以及Western blot检测。

1．3．4β4GalTⅡ蛋白的表达和定位取转染后24 h左右的细胞培养皿，弃培养基，预冷的PBS清洗3次，弃去PBS；-20℃预冷的甲醇固定5 min，吸弃甲醇；70%的乙醇溶液固定5 min，弃乙醇；PBS洗3次，每次5min，弃PBS（若为GFP标签就直接行DAPI染核）；含1%脱脂奶粉的TBST室温封闭30min，弃封闭液；FLAG一抗（1∶100比例用封闭液稀释）室温下孵育2 h，弃一抗；封闭液清洗3次，每次5 min；将TRITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗（1∶100）室温下孵育1 h，弃二抗；PBS洗3次，每次5 min；0．5μg／ml的DAPI溶液100μl室温染核2 min，弃DAPI；PBS洗3次，每次5 min；用滤纸吸尽盖玻片上的残液，用荧光封片胶（Dako）将盖玻片封于洁净的载玻片上；4℃避光储存，次日在荧光显微镜下观察并拍照。

1．3．5Western blot检测转染48 h后，收集HEK 293T细胞以提取总蛋白。加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解30 min；4℃、14 000 r／min离心15 min；取适量上清液加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮沸5 min后冰浴冷却；经12%SDSPAGE凝胶电泳分离后，100 V恒压电转1 h至PVDF膜上；用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h；加入FLAG一抗或GFP一抗（1∶500稀释），4℃孵育过夜；TBST洗膜后，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗或山羊抗兔IgG（1∶5 000稀释）室温孵育1．5 h；TBST洗膜后，暗室ECL显影。实验重复3次。

2　结果

2.1β4GalTⅡPCR扩增产物的鉴定及重组表达质粒的酶切鉴定抽提的重组质粒pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG使用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，pCDGFP-β4GalTⅡ则使用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，经与DNA Marker比对，一条位于酶切空载体pcDNA3．1 （5 400 bp）、pCDGFP（6 100 bp）处，另一条目的条带位于1 119 bp处，表明连接成功，见图1。

3　讨论

2．2测序结果的比对将酶切鉴定正确的两种不同标签的质粒测序结果与NCBI上公布的β4GalTⅡ进行核酸序列和蛋白质序列比对，核苷酸序列均与β4GalTⅡ相同，且氨基酸编码正确。质粒测序结果证实插入片段的测序结果与β4GalTⅡ全长序列完全一致，说明重组表达质粒 pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG、pCDGFP-β4GalTⅡ构建正确，见图2。

2.3β4GALTⅡ蛋白在COS7细胞内的定位GFP蛋白在COS7细胞中的表达弥散分布在整个细胞中，但两种不同标签的β4GALTⅡ蛋白均在COS7细胞中表达在细胞核周围，并有明显的块状染色，胞核中未见明显分布，见图3。

2.4β4GALTⅡ蛋白在HEK 293T细胞中的表达

经过Western blot检测，在转染pcDNA3．1（＋）空载体的HEK 293T细胞裂解液泳道内未出现泳带，而转染pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG的HEK 293T细胞裂解液中检测到一条约42 ku的条带，这与β4GalTⅡ-FLAG表达的蛋白分子量大小一致；与此相对应的是，在转染pCDGFP空载体的HEK 293T细胞裂解液中出现一条约27 ku的条带，转染 pCDGFP-β4GalTⅡ的HEK 293T细胞裂解液中检测到一条约70 ku的条带，这与GFP绿色荧光蛋白及GFP-β4GalTⅡ融合蛋白的大小也完全一致。结果表明β4GalTⅡ蛋白在HEK 293T细胞中能够有效表达，见图4。

本研究将β4GalTⅡ分别与pcDNA3．1（＋）和pCDGFP空载体融合，首次选用贴壁牢固、铺展较开的COS7细胞，并且运用免疫荧光显微镜成功地观察到β4GalTⅡ蛋白在该细胞内的定位情况。加之结合DAPI染核技术，细胞核显示出蓝色荧光，能够清楚地展示细胞核及其周边情况，从而有效地保证了定位的准确性。由于蛋白标签的引入可能会对蛋白的定位产生干扰，为了更为直观地展示出β4GalTⅡ蛋白的定位情况，在构建FLAG标签的β4GalTⅡ真核表达载体进行荧光定位的同时，又构建了GFP标签的β4GalTⅡ真核表达载体同步进行荧光定位对比。同时辅以GFP空白对照作为报告基因共同研究该蛋白的亚细胞定位，避免假象干扰实验，得出错误结论。结果由图3可知：GFP蛋白在 COS7细胞中的表达弥散分布在整个细胞中，但两种不同标签的β4GALTⅡ蛋白在COS7细胞中均表达在细胞核周围，并有明显的块状染色，荧光强度远超过胞质其他部位，胞核中未见明显分布，定位没有因标签改变而发生明显变化，这些结果表明，标签融合到主体蛋白β4GALTⅡ中进行靶向标记并未造成其分子结构的空间位阻，导致荧光蛋白的互补结合失败，因而便于笔者后续研究中通过互换标签方式，正反向检测与之结合的蛋白分子间的相互作用。

HEK 293T细胞作为一种表达SV40病毒T抗原的细胞系，增殖速度快，转染效率高，蛋白表达水平高，较易检测，非常适用于外源基因的过表达分析。本研究首次选用HEK 293T细胞探究β4GalTⅡ蛋白的表达，图4显示两种标签的β4GalTⅡ蛋白均可在HEK 293T细胞稳定表达，这为该基因在HEK 293T细胞内进行功能研究的转染表达实验提供了依据。

β1，4-半乳糖转移酶（β4GalTase）家族迄今为止已知含有7个家族成员（β4GalTⅠ-Ⅶ）。据氨基酸序列比对和系统发育学分析，β4GalTase家族又可分为4个亚族，属于Ⅱ型膜蛋白［1，6］。近年来对β4GalTⅠ结构和功能的研究较为广泛，但对与其同源性最高的β4GalTⅡ的研究还不多。有研究［3，7-8］显示β4GalTⅡ和β4GalTⅠ、β4GalTⅣ共同参与哺乳动物体内大多数N-寡糖链的生物合成，其作用是以催化从UDP-半乳糖苷转移到-N多糖复合物末端的N-乙酰氨基葡萄糖上，形成β-1，4糖苷键，以对蛋白质进行糖链修饰，从而参与糖复合物的形成。也有研究［5，7］表明，β4GalTⅡ依赖其高尔基复合体定位发挥促凋亡作用，同时，该机制的调节是因为β4GalTⅡ可能作为p53转录因子的靶基因参与了p53介导的由DNA损伤剂诱导的Hela细胞凋亡。同时，Kouno et al［9］的研究认为β4GalTⅡ能与葡萄糖醛酸转移酶（GlcAT-P）形成复合物，参与HNK-1聚糖的合成，从而间接地参与突触可塑性及树突的成熟。还有研究［10］显示β4GalTⅡ可作为参与聚糖合成的主要调节因子，参与神经发育中糖链的合成。既往研究［4-6，9］报道β4GalTⅡ蛋白在人类白血病细胞（K562，K562／ADR，HL60，HL60／ADR，NB4，NB4／ADR，U937，U937／ADR）及骨髓单核细胞（BMMC）、增殖表皮癌细胞（Hela）、昆虫细胞（Sf-9）、小鼠神经母细胞瘤细胞（N2a）等多种细胞中均可表达且发挥不同的作用。即使如此，人们对β4GalTⅡ的生理功能尚知之不多，仍在进一步探索中。

笔者所在的研究组在早期的酵母双杂交文库筛选工作中利用诱饵蛋白筛选到β4GalTⅡ基因的蓝色克隆，因而本研究运用基因克隆技术构建两种不同标签的β4GalTⅡ真核表达载体，并首次报道了β4GalTⅡ转染进COS7的定位情况，鉴于该蛋白在核周围明显的块状染色情况，提示其可能定位于某个细胞器上，关于其精确的亚细胞定位尚需β4GalTⅡ与可能的细胞器特异标记分子的共定位实验进行证实。同时也将β4GalTⅡ蛋白首次转染进HEK 293T细胞内，初步探索了人β4GalTⅡ在哺乳动物细胞内的表达情况。本研究为课题组进一步研究β4GalTⅡ的分子功能及其与从人类Hela细胞的cDNA基因文库中筛选出该蛋白的诱饵蛋白之间的相互作用及其作用机制奠定了非常重要的基础，后续实验将对此做更深入的研究。

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Xu Xueqin，Pan Linxin，Geng Huiwu，et al
（Dept of Biology，AnhuiMedical University，Hefei230032）

The expression and localization ofβ4GalTⅡ in mammalian cell lines

AbstractObjectiveTo construct the eukaryotic expression plasmids tagged FLAG or GFP ofβ4GalTⅡgene by PCR，then the plasmidswere transfected into COS7 cells respectively to investigate the localization of recombinant proteins．They were also transfected into HEK 293T cells to define their expression．MethodsSpecific primers with FLAG or GFP tag were designed forβ4GalTⅡgene．The gene encodingβ4GalTⅡwas amplified directly by PCR using cDNA fragment as template．Then the amplified productswere ligated into the eukaryotic expression vectors pcDNA3．1（＋）and pCDGFP to construct recombinant plasmids．Both of the plasmidswere confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing．The plasmidswere transfected into COS7 and HEK 293T cells respectively via Lipofectamine 2000 Reagent．The localization and expression of the recombinant proteins in cells were examined by the fluorescence microscopy or Western blot．ResultsThe pcDNA3．1-β4GalTⅡ-FLAG and pCDGFP-β4GalTⅡrecombinant expression vectors were successfully constructed and expressed in eukaryotic cells．The results which observed by the fluorescence microscope demonstrated that bothβ4GalTⅡ-FLAG and GFP-β4GalTⅡproteinswere predominantly detected in the perinuclear spot and showed obvious signs ofmassive dying，and they were not distributed in the nucleus evidently．Western blot identified that both of theβ4GalTⅡtagged FLAG and GFP could express stably in HEK 293T cells．ConclusionConstruction of eukaryotic expression recombinant plasmids ofβ4GalTⅡgene provides some basis for further function studies ofβ4GalTⅡin cells and their interaction with other proteins．

Key wordsβ4GalTⅡ；transfection；cellular localization；protein expression

中图分类号R 341；R 394．2

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1610-05

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（编号：81201368）

作者单位：安徽医科大学生命科学学院生物学教研室，合肥230032

作者简介：徐雪琴，女，硕士研究生；