人源性肝癌异种移植动物模型的建立及CD90、ALDH1表达鉴定

博庆丽，阮　亮，胡安拉，李　李，杨　懿，赵奇红

人源性肝癌异种移植动物模型的建立及CD90、ALDH1表达鉴定

博庆丽1，阮亮1，胡安拉1，李李1，杨懿2，赵奇红1

摘要从新鲜的人肝癌标本上切除肿瘤组织，移植于裸鼠皮下，建立原代移植瘤并连续传代3次，观察移植瘤的成瘤潜伏期、成瘤率、肿瘤体积、肿瘤的侵袭和转移情况。通过HE染色，与临床标本进行组织病理学比较，利用免疫组化方法比较肿瘤干细胞标志物CD90和乙醛脱氢酶1（ALDH1）在临床和动物模型组织中的表达变化。结果显示动物模型肿瘤组织和临床肿瘤组织结构类似；CD90、ALDH1表达一致。建立人源性肝癌移植动物模型，其组织结构稳定，某些特定蛋白表达一致，可成为肝癌基础研究的重要工具。

关键词肝癌；人源性组织异种移植；动物模型

2015-06-29接收

医学院病理学系，合肥230032

赵奇红，男，讲师，责任作者，E-mail：qihong＠ahmu．edu．cn

目前，手术切除及肝脏移植是肝癌治疗的首要选择，然而肝癌发病隐匿，进展迅速，大多数患者确诊时已失去手术最佳时机，病死率居高不下。因此，有必要建立与人类临床肝癌特征相似的人源性肿瘤动物模型，以加快抗肝癌药物的研发和治疗方案的制定，促进肝癌的转化医学研究。该研究利用裸鼠作为人原发性肝癌组织异种移植的宿主，建立多例能传代和复苏的并能保持肝癌临床组织特征的实验动物模型，即人源性肿瘤组织异种移植模型（patient derived tumor xenograftmodel，PDX模型），并对这些模型的组织结构，某些特定蛋白表达进行评价。

1　材料与方法

1．1实验动物BALB／c雌性裸鼠225只，SPF级，4～6周龄，（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房（25±2）℃，40%～70%湿度，12 h∶12 h昼夜交替，自由饮食。开始实验前小鼠适应性饲养3 d以上。由于临床标本运达时间不一，购买小鼠需要有周龄梯度。接种开始于6周龄小鼠。

1．2试剂与耗材Hank′s平衡液（HBSS）购自Gibco公司（货号：14170）。Matrigel购自Corning公司（货号：354234）。一次性细胞培养皿购自Greiner bio-one公司（货号：664-160）。其余试剂或耗材（纱布、一次性手术器材等）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1．3肿瘤标本来源与处理肝癌新鲜组织标本均收集于安徽医科大学第一附属医院，在患者知情同意的情况下收集临床手术的肿瘤标本，共30例。术中切除标本之后，立即放入 HBSS中，运至实验室。在生物安全柜内清除组织表面的坏死物并洗净血液。肿瘤接种在手术后4 h内完成。

1．4肿瘤移植方法与传代取临床手术切取的新鲜无菌肝癌组织标本，选择肿瘤活力较好的组织，用组织剪将肿瘤组织剪成约1 mm×2 mm×2 mm的小块，与Matrigel混好后装入接种针待用。将小鼠两侧背部后1／3皮肤酒精消毒备皮，正确姿势抓起小鼠，用无菌组织剪剪开0．5 cm长的切口，将穿刺针由切口处刺入背部皮下，针头进入约2 cm，将肿瘤组织快速注入皮下，将穿刺针旋转拔出，用酒精棉签将渗血处理干净，以防止残留血液引起老鼠噬咬。对侧做同样处理，每例标本分别接种5只小鼠，术后继续饲养。每周测量动物体重2次，当成瘤后，每周测量肿瘤的长径和宽径2次，并计算相对肿瘤的体积（相对肿瘤体积＝0．52×长径×短径2）。当G0代肿瘤生长至500 mm3时进行体内传代（记录G1），随后传代分别记为G2、G3代等。

1．5模型监测指标①每天观察小鼠的背部愈合情况、毛色、精神状态、活动力、饮食等。②观察并记录局部皮下移植瘤的成瘤潜伏期，以接种肿瘤组织至皮下扪及黄豆大小微结节为成瘤潜伏期。③观察并记录小鼠的成瘤率、存活率及死亡率。④处死小鼠后取出移植瘤，观察移植瘤外观，将患者肿瘤标本及每代移植瘤分别做常规病理切片苏木精-伊红染色（HE染色），观察肿瘤的组织形态学特征。⑤通过免疫组织化学方法检测患者肿瘤标本与移植瘤中肿瘤干细胞标志物CD90和乙醛脱氢酶1 （aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1）的表达变化。

2　结果

2．1小鼠生长情况手术后第2天，精神状态恢复良好，活动力较好，饮食正常，手术后14 d，背部皮肤愈合，毛色正常。

2．2小鼠成瘤潜伏期及荷瘤鼠生长情况肝癌临床标本移植后4周左右于接种部位可扪及黄豆粒大小，可在皮下移动，质地稍硬的实体肿块，随后肿瘤结节逐渐增大，6周左右可看到突出于皮肤的肿块，随着肿瘤的不断增大，小鼠出现不同程度的消瘦、弓背等情况，见图1。移植瘤连续传代后，成瘤潜伏期由4周逐渐稳定在3～4周。

2．3小鼠成瘤率和肿瘤生长速度患者肝癌标本进行裸鼠的原代移植，每例标本移植5只，共150只。其中15例临床标本移植成功，原代移植成瘤率为50%。G1代移植15例，G2代移植6例。以移植4周以后背部能扪及黄豆粒大小肿块认为肿瘤成瘤，肿瘤生长后无自然消退情况。除了接种过程导致某些肿瘤形状极为不规则而剔除外，其余肿瘤生长情况见图2。

2．4患者标本及移植瘤组织病理学检查待荷瘤鼠肿瘤长至足够大，或出现明显消瘦和倒毛现象，将小鼠颈椎脱臼处死，取出移植瘤，可见移植瘤表面光滑，为圆形或类圆形实体瘤，质地稍硬。其他脏器表面无转移瘤结节，亦无其他组织或器官浸润现象。将患者标本及每代移植瘤做病理切片，HE染色，400倍光镜下观察。发现移植瘤组织状态（图3中B、C、E、F图）与临床患者肝癌组织（图3中A、D图）形态特点基本相同，具体表现有：肝脏正常的组织结构消失，癌细胞呈圆形、椭圆形、不规则形等形态大小不一，细胞分界模糊，癌细胞排列松散；核仁较大，染色质浓染，胞质所占比例较小，可以见到核分裂相。见图3。

2.5患者标本及移植瘤中肿瘤干细胞标志物CD90和ALDH1的表达临床标本和移植瘤切片的免疫组化结果显示，患者的临床标本（图4中A、D图）和动物移植瘤（图4中B、C、E、F图）中的肿瘤干细胞标志物CD90表达一致，主要在细胞膜上表达，胞质中很少或不表达，见图4；ALDH1在这两种来源的组织细胞膜和胞质中均有表达。其结果和患者肿瘤的临床标本基本一致，见图5。

3　讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，起病隐匿，病程较短，病死率较高。因此建立良好的肝癌动物模型是进行医学和实验研究的重要手段和平台，对肝癌发生机制、诊断与治疗研究有很重要的意义［1］。

PDX模型是将患者的新鲜肿瘤组织处理后移植到免疫缺陷或裸鼠上，依靠小鼠提供的微环境进行生长，异种移植的模型可能是最接近目前人类癌症特点的［2］。与人癌细胞系建立的动物模型相比，PDX模型减少了体外处理过程，能更好地保持患者临床肿瘤组织的原有生物学特性和组织学特征，并且PDX模型取材于不同的患者，可以保留了患者肿瘤的异质性，不仅可以检测治疗功效，也是符合癌症生物学治疗基本原则的一种工具和手段［3］，还可以帮助测试新的抗肿瘤药物的疗效［4］，同时也为肿瘤发生发展的机制研究提供了新的方法，为一对一的个体化抗癌治疗提供了可能。在本研究所建的模型中，PDX模型的移植瘤与人来源的肿瘤标本有一致的组织特征，可见肝脏正常的组织结构消失，癌细胞呈圆形、椭圆形、不规则形等形态，大小不一，细胞分界模糊不清，癌细胞排列松散；核仁较大，染色质浓染，胞质所占比例较小等。肿瘤干细胞标志物CD90和ALDH1检测显示在移植瘤与患者肿瘤的临床标本表达阳性，一方面说明其在肿瘤发生发展中起作用，亦提示该模型保留了原癌的生化特点。这与其他研究人员对不同肿瘤的研究相一致，如乳腺癌、腹水型卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、食管癌等也同样证实了PDX模型保持了原代肿瘤的生物学特性，是一个稳定、可靠的癌症研究模型，为研究癌症提供了很好的动物模型［2，5-8］。

参考文献

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［3］Dobbin Z C，Katre A A，Steg A D，et al．Using heterogeneity of the patient-derived xenograft model to identify the chemoresistant population in ovarian cancer［J］．Oncotarget，2014，5（18）：8750 -64．

［4］刘情，郑琳，张灏．人源性肿瘤组织异种移植模型的研究进展［J］．转化医学杂志，2014，3（2）：65-8．

［5］姚凤秋，凌斌，赵卫东，等．人腹水型卵巢癌SCID鼠腹腔移植瘤的建立［J］．安徽医科大学学报，2006，41（2）：124-6．

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［7］Laurent C，Gentien D，Piperno-Neumann S，etal．Patient-derived xenografts recapitulatemolecular features of human uvealmelanomas［J］．Mol Oncol，2013，7（3）：625-36．

［8］Zhang J，Jiang D，Li X，et al．Establishment and characterization of esophageal squamous cell carcinoma patient-derived xenograft mouse models for preclinical drug discovery［J］．Lab Invest，2014，94（8）：917-26．

Establishment of patient-derived liver cancer xenograftmodels and assessment of the expression of CD90 and ALDH1

Bo Qingli，Ruan Liang，Hu Anla，et al
（School of Public Health，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractFresh specimens excised from the patientswith liver cancer were transplanted into nudemice subcutaneously to establish the patient-derived liver cancer xenograftmodels，which could be passaged 3 times continuously．The tumor latency，take rate，tumor growth，invasion and metastasis of thesemodelswere recorded meanwhile．Histopathological structure was compared by HE staining in the clinical samples and the passaged samples．The expression status of cancer stem cellmarkers CD90 and aldehyde dehydrogenase 1（ALDH1）were checked in these samples using immunohistochemicalmethods．Similar histopathological structure was observed in those samples，and so did the expression of CD90 and ALDH1．Thesemodels are valuable for the basic researches in liver cancer，which had the characters of stable histopathological structure and stable expression of some certain proteins．

Key wordslive cancer；patient-derived xenograft；animalmodel

中图分类号R 965．1

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1698-04

基金项目：安徽医科大学校级科学研究基金（编号：2012xkj015）；安徽医科大学博士科研资助项目（编号：XJ201111）；安徽省高等学校省级优秀青年人才基金（编号：2012SQRL072）；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（新教师类）（编号：20123420120012）

作者单位：安徽医科大学1公共卫生学院营养与食品卫生系、2基础

作者简介：博庆丽，女，讲师；