人E2F1蛋白的表达及与Sed lin蛋白共定位研究

汪燕燕，潘林鑫，王梦媛，刘晓颖，范礼斌

人E2F1蛋白的表达及与Sed lin蛋白共定位研究

汪燕燕，潘林鑫，王梦媛，刘晓颖，范礼斌

摘要目的研究人E2F1蛋白在真核细胞内的表达及其与Sedlin蛋白的共定位。方法构建pcDNA3．1-E2F1-FLAG真核表达质粒，然后瞬时转染至HEK 293T细胞内，Western blot法检测E2F1蛋白的表达；瞬时单转E2F1-FLAG和共转E2F1-FLAG＋Sedlin-绿色荧光蛋白（GFP）至非洲绿猴肾细胞（COS7）内，免疫荧光制片，荧光显微镜下观察E2F1-FLAG在细胞内的定位及其和Sedlin的共定位。结果真核表达质粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG构建成功，且在HEK 293T细胞中能够成功表达，在COS7细胞中主要定位在细胞核，且与Sedlin共定位于细胞核。结论人E2F1在HEK 293T、COS7细胞中都能够正常表达，且与Sedlin蛋白存在共定位现象，为进一步了解人E2F1的功能及其蛋白质相互作用提供了一定的细胞学基础。

关键词E2F1；转染；基因表达；细胞定位

细胞周期相关转录因子E2F1，最早是在研究［1［2］。该研究通过构建下游带FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG，过表达于HEK 293T和非洲绿猴肾细胞（COS7）细胞中，探讨E2F1蛋白在真核细胞中的表达及其与Sedlin蛋白的共定位情况，现报道如下。

2015－05－18接收

1　材料与方法

1．1质粒、菌株和细胞

包含人E2F1的cDNA序列由厦门大学韩家淮院士友情惠赠；TG1和DH5a大肠杆菌菌株、pcDNA3．1（＋）表达载体、pCD绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）-Sedlin表达质粒、以及COS7、HEK 293T细胞株皆由安徽医科大学生命科学院生物学实验室保存。

1．2主要试剂与仪器

扩增引物由上海生工生物公司合成；DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、Lambda DNA／EcoRⅠ＋HindⅢMarker以及T4 DNA连接酶均购自美国Fermentas公司；蛋白预染Marker购自美国Bio-rad公司；特级胎牛血清购自美国Clark公司；DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；Opti-MEM减血清培养基和脂质体2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；FLAG M2单克隆抗体购自美国Sigma公司；Western blot及IP细胞裂解液和一抗、二抗稀释液均购自上海碧云天研究所；HRP和四甲基异硫氰酸罗丹明标记的山羊抗小鼠lgG抗体均购自北京中杉金桥公司；ECL显色试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；荧光显微镜购自德国Leica公司。

1．3方法

1．3．1质粒构建［3］

设计、合成下游带有FLAG标签的E2F1引物，上游引物：5’-CGGGATCCCGCCACCATGGCCTTGGCCGGGGC-3’；下游引物：5’-GGAATTCCTCA CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTC GA AATCCAGGGGGGTGA-3’（斜体为FLAG标签），以含人E2F1全长cDNA序列的质粒为模板，PCR扩增出目的片段；琼脂糖电泳，胶回收试剂盒回收PCR产物；限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ分别对E2F1的PCR产物和pcDNA3．1（＋）载体进行双酶切；16℃条件下，用T4连接酶连接过夜；次日用TG1或DH5a对连接产物进行转化，37℃倒置培养；待长出单克隆，挑取数个单克隆进行摇菌，碱裂解法抽提质粒；EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切鉴定，选择1管鉴定正确的质粒送生工有限公司测序。

1．3．2细胞准备

在蛋白表达的实验中，对HEK 293T细胞进行常规传代，以适当的密度接种至直径为60 mm的培养皿中，培养过夜后待转染。在免疫荧光实验中，对COS7细胞进行常规传代，在传代的同时，取1张无菌的盖玻片放入直径为35 mm的培养皿中，用适当浓度的多聚赖氨酸对盖玻片进行包被，充分晾干后种入适当密度的细胞，培养过夜后待转染。

1．3．3质粒转染

在蛋白表达的实验中，待接种的HEK 293T细胞生长至密度约90%时，根据脂质体2000转染试剂盒操作说明对细胞进行转染，转入质粒的量约为5μg，转染后在Opti-MEM无血清培养基中继续培养约6 h，换含有5%胎牛血清的培养基继续培养，约48 h后收集细胞；在免疫荧光实验中，转染前COS7细胞密度约为50%，转染方法同蛋白表达实验。

1．3．4Western blot法检测［4］

转染24～48 h后，胰酶消化细胞，离心后收集细胞，PBS清洗2次；适量细胞裂解液悬浮细胞，4℃混悬30～60 min后，超声破碎3 s；14 000 r／min、4℃离心10min收集上清液，即蛋白样品；取适量加入等量的SDS上样缓冲液（2×），沸水浴5 min后置冰水中冷却；取适量样品上样，SDS-PAGE电泳（100 V、2 h），恒压湿转（100 V、1 h）；5%的脱脂奶粉或BSA溶液封闭1～2 h；一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜或室温孵育2 h，TBST溶液洗膜3次；HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，TBST溶液洗膜；暗室中进行显影。

1．3．5免疫荧光实验检测［5］

转染后24 h左右，轻轻取出细胞爬片，细胞面朝上放置；滴加PBS清洗2～3遍；甲醇溶液（－20℃冷藏）固定2 min，70%的乙醇溶液继续固定5 min，弃去乙醇；PBS清洗3次，用脱脂奶粉溶液（1%，TBST配制）封闭0．5 h，弃去封闭液；适量的一抗溶液（1∶200）室温孵育1．5～2 h，弃一抗；封闭液清洗3次后，用适量的四甲基异硫氰酸罗丹明标记的二抗溶液（1∶200）室温避光孵育1 h，弃二抗；PBS清洗3～4次，适量的DAPI（150 mg／L）溶液染色，室温2～3 min，弃DAPI溶液；PBS溶液清洗3次，用滤纸尽量吸去细胞爬片上残留的液体，用封片胶将爬片的细胞面轻轻封于干净的载玻片上；待爬片固定后在荧光显微镜下进行观察和拍摄。

2　结果

2.1pcDNA3.1-E2F1-FLAG质粒的酶切鉴定

对重组质粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG进行BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切，酶切鉴定的结果见图1，第2泳道的重组质粒pcDNA3．1-E2F1-FLAG酶切后得到2条亮带，通过与pcDNA3．1空载体酶切产物、E2F1 PCR产物以及Marker的横向对比表明，一条亮带是载体pcDNA3．1（5 400 bp），另一条亮带是目的片段E2F1 （1 314 bp），表明该质粒成功连接。后续的测序结果也表明连接正确。

2.2E2F1蛋白在HEK 293T细胞中的表达

过表达E2F1的HEK 293T细胞裂解液，Western blot法分析后结果见图2，转染了pcDNA3．1-E2F1-FLAG 的HEK 293T细胞裂解液能够检测到条带，通过与预染蛋白Marker的横向比较，显示条带大小约为60 ku，与E2F1蛋白的分子量基本一致，且未转染质粒的HEK 293T细胞裂解液未检测到任何条带，表明E2F1蛋白能够在HEK 293T细胞中成功表达。

2.3E2F1蛋白在COS7细胞中的定位

利用荧光显微镜观察E2F1-FLAG在COS7细胞中的定位，E2F1蛋白主要定位在细胞核内。见图3。

2.4E2F1蛋白与Sed lin蛋白在COS7细胞中的共定位

利用荧光显微镜观察E2F1-FLAG与Sedlin-GFP在COS7细胞中的共定位，E2F1蛋白与Sedlin蛋白存在共定位现象，主要共定位在细胞核内。见图4。

3　讨论

本研究通过质粒构建、Western blot法、免疫荧光等技术研究了E2F1在真核细胞内的表达和定位以及和Sedlin蛋白的共定位情况，结果表明，E2F1 在HEK 293T细胞内能够成功表达，且在COS7细胞中的分布主要集中在细胞核，并与Sedlin蛋白共定位于细胞核，这将为继续研究E2F1和Sedlin之间的相互作用的精细机制提供基础。蛋白表达实验之所以选择HEK 293T是由于该细胞有较快的生长速度，而且转染效率很高，蛋白表达量多，是瞬时转染获得胞内外蛋白常用的细胞株。荧光定位的实验之所以选择COS7细胞是由于该细胞有较强的贴壁能力，适合后期的免疫制片，而且其形态较大，铺展较开，适合观察蛋白的定位情况。

E2F家族目前有8个成员，命名依次为E2F1～8，家族成员之间存在着高度同源性，大部分成员都包含以下几个保守区域：DNA结合区域、转录活化结合区域、DP二聚体结合区域。不同的E2F成员有特异性的结合区，根据启动子的转录调节特性可以将E2F家族蛋白分为两类：E2F1、E2F2和E2F3a称为转录激活因子，受pRb的调节，促进细胞由G1 往S期的转换［6］。E2F3b、E2F4、E2F5、E2F6、E2F7 和E2F8称为转录抑制因子，主要抑制细胞周期的转化。在E2F家族中，活性最有特点的就是E2F1。E2F1是细胞周期重要的调控因子，当细胞周期处于G0／G1早期时，E2F1与DP、RB1结合形成一个复合物，其中E2F1的转录活性被未磷酸化的pRb所抑制［7］，同时也抑制了E2F1下游靶基因的表达。当细胞周期至G1晚期时，随着Cyclin D／CDK4／6、Cyclin E／CDK2复合物的表达，引起pRb的高度磷酸化，导致大量E2F1被释放，进而转录激活下游靶基因，促进细胞进入S期。当细胞周期处于S期时，E2F1在Cyclin A／CDK2复合物的催化下磷酸化失活，导致细胞进入G2／M期［8］。当细胞进入到新的细胞周期时，pRb将去磷酸化，与E2F1再次结合。E2F1的转录调节功能除了与RB1／E2F1信号通路有关外，还与依赖p53负反馈环［9］、miR-17／miR-20a miRNAs信号通路［10］的调控密切相关。除了对细胞周期的调控，E2F1还参与了细胞凋亡的诱导。另外，E2F1与肿瘤的发生发展有着密切的关系，在许多癌症中都存在E2F1高表达的现象，如子宫内膜癌［11］、乳腺癌［12］等，但在某些癌症中E2F1的表达量却有所降低，如肝癌［13］，由此可见，E2F1存在癌基因和抑癌基因的双重特性，因此，对其进行深入研究意义重大。在接下来的研究中，将用蛋白下拉技术、免疫共沉淀等技术，对E2F1和Sedlin的相互作用做进一步研究。

参考文献

［1］Kovesdi I，Reichel R，Nevins J R．Identification of a cellular transcription factor involved in E1A trans-activation［J］．Cell，1986，45（2）：219－28．

［2］ChoiM Y，Chan CC，Chan D，et al．Biochemical consequences of sed lin mutations that cause spondyloepiphyseal dysplasia tarda ［J］．Biochem J，2009，423（2）：233－42．

［3］潘林鑫，李新颖，徐南，等．人RB1及其突变体的表达与定位［J］．安徽医科大学学报，2013，48（8）：853－8．

［4］乔正，赵健，潘林鑫，等．人RACK1蛋白在HEK-293T和BL21细胞中的表达及COS7细胞的定位［J］．安徽医科大学学报，2014，49（9）：1189－92．

［5］李春雨，潘林鑫，刘晓颖，等．人类胞内氯离子通道蛋白3在原核细胞及真核细胞内的表达［J］．安徽医科大学学报，2014，49 （9）：1202－5．

［6］Johnson D G，Schwarz JK，CressW D，etal．Expression of transcription factor E2F1 induces quiescent cells to enter Sphase［J］．Nature，1993，365（6444）：349－52．

［7］Ferreira R，Naguibneva I，Mathieu M，et al．Cell cycle-dependent recruitment of HDAC-1 correlates with deacetylation of histone H4 on an Rb-E2F target promoter［J］．EMBO Rep，2001，2 （9）：794－9．

［8］Mund le SD，Saberwal G．Evolving intricacies and implications of E2F1 regulation［J］．FASEB J，2003，17（6）：569－74．

［9］Sharma N，Timmers C，Trikha P，et al．Control of the p53-p21CIP1 Axis by E2f1，E2f2，and E2f3 is essential for G1／Sprogression and cellular transformation［J］．JBiolChem，2006，281 （47）：36124－31．

［10］Pickering M T，Stadler B M，Kowalik T F．miR-17 and miR-20a temper an E2F1-induced G1 checkpoint to regulate cell cycle progression［J］．Oncogene，2009，28（1）：140－5．

［11］刘向真，王如美．乳腺癌组织中E2F-1和Skp2的表达及意义［J］．现代肿瘤医学，2012，20（11）：2286－8．

［12］庞志澜，马丽辉，孔卫平，等．子宫内膜癌中E2F-1、Survivin和ki-67的表达及相关性［J］．现代肿瘤医学，2013，21（7）：1581 －5．

［13］王长青，吴江，周娟．E2F-1基因对HepG2肝癌细胞增殖影响的研究［J］．医学综述，2013，19（4）：722－4．

中图分类号R 341；R 394．2

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1377－04

基金项目：国家自然科学基金青年基金（编号：81201368）；安徽省级大学生创新创业训练计划项目（编号：AH201410366017，AH201410366132）

作者单位：安徽医科大学生命科学院生物学教研室，合肥230032

作者简介：汪燕燕，女，硕士研究生；刘晓颖，女，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：liuxiaoying＠ahmu．edu．cn；范礼斌，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：lfan＠ahmu．edu．cn

The expression of human E2F1 and the co-localization with Sed lin

Wang Yanyan，Pan Linxin，Wang Mengyuan，etal
（Dept of Biology，College of Life Sciences，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the expression and localization of E2F1 in eukaryotic cells and the co-localization with Sedlin．MethodsTo construct eukaryotic expression plasmid pcDNA3．1-E2F1-FLAG．The plsamid was transfected into HEK 293T cells and the expression was checked by Western blot．Its expression in COS7 cells was detected by fluorescencemicroscopy．Resu ltsThe eukaryotic expression plasmid of pcDNA3．1-E2F1-FLAG was constructed successfully，which could be effectively expressed in HEK 293T and COS7 cells．E2F1 was predominantly distributed in the nucleus，and it co-localized in the nucleus with Sedlin．ConclusionE2F1 can overexpress efficiently in HEK 293T and COS7 cells，and it can colocalize with Seldin，which provides important bases for further study on E2F1 including its functions and associated proteins．

Key wordsE2F1；transfection；gene expression；cellular localization