猪圆环病毒2型分子生物学研究进展

李富强　王利丽　李秀丽

摘 要：猪圆环病毒 2 型 （PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病 （PCVAD） 的主要病因。目前流行的 PCV2 被分为PCV2a 和 PCV2b 两个亚群。北美和其他国家 PCVAD 的暴发通常与主要基因型从PCV2a转变为PCV2b 有关。本文对圆环病毒2型的分子结构及其表达产物的生物学活性的研究进展进行了综述，最后对分子差异和致病性进行了讨论。

关键词：猪圆环病毒2型；分子结构；致病性；

中图分类号：S852.65 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.013

Progress on Molecular Biology of PCV2

LI Fu-qiang，WANG Li-li， LI Xiu-li

（Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Tianjin 300384，China）

Abstract：Porcine circovirus type 2 （PCV2） was the main cause of porcine circovirus virus associated disease （PCVAD）.PCV2a and PCV2b，two subgroups of PCV2，were epidemic recently. In North America and other countries ，PCVAD outbreaks were usually related to main genotype from PCV2a into PCV2b.In this paper， the molecular structure of the porcine circovirus virus type 2 and the research progress of its expression product biological activities were summarized， and finally discussed the relation of molecular differences and pathogenicity were discussed.

Key words： porcine circovirus type 2； molecular structure； pathogenicity

20世纪70年代，Tischer等报道PK-15（ATCC-CCL3）细胞系受到某种病毒污染，生化分析表明该病毒基因组为环状单链DNA，故命名为猪圆环病毒。早期试验性感染表明，PK-15感染病毒后没有引发具有临床症状的疾病。直到20世纪90年代，加拿大出现一种名为PMWS的新型衰竭性疾病。利用PCV特异性单克隆抗体进行电镜和免疫组化试验，证实感染猪的组织中存在圆环病毒。经PCR扩增后分析序列，发现该病毒与早期感染PK-15细胞系的病毒约有70%的相似性，因此人们用PCV1和PCV2来区别PK-15细胞系污染病毒和PMWS病例分离株。

1 病毒结构及病原生物学特性

猪圆环病毒2型属于圆环病毒科圆环病毒属，单股负链环状不分节无囊膜DNA病毒。基因组全长约1 767～1 768 bp，衣壳蛋白呈二十面体对称[1]。

对于PCV2的生物学特性和理化特性与PCV1相似。与福尔马林、酒精、碘酒和双氯苯双胍己烷室温下作用10 min，病毒滴度会下降。对苯酚、季胺类化合物、氢氧化合物等较敏感[2]，不凝集人、猴、猪、兔、小鼠及鸡的红细胞[3]。PCV2体外培养不能在猪胎肾原代细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞上生长，可在PK-15细胞中生长但不引起细胞病变。自然宿主为家猪和野猪，猪科以外动物不易感染PCV2。传播途径主要为接触感染，感染动物的粪便、尿液、唾液及精液均含有病毒[4]。

2 基因结构及病毒蛋白生物学活性

PCV2基因组由11个开放阅读框（ORFs）组成，其中ORF1和ORF2为两个主要阅读框。目前的研究主要集中在ORF1，ORF2，ORF3，ORF4和ORF5 五个阅读框。

ORF1靠近PCV2基因组起始位点，位于正链方向，ORF1基因全长945 nt，编码314个氨基酸，翻译成复制酶蛋白Rep和Rep。Rep由整个ORF1翻译而成。分子质量36 ku，含3个N -糖基化位点。研究表明，位于蛋白23-25位aa（NPS）、256-258aa（NQT）的N-糖基化位点发生突变能够降低病毒复制，286-288aa（DAT）的N-糖基化位点发生突变能够促进病毒复制[5]。Rep蛋白含有3个保守基列，是典型滚环复制相关位点。此外，还有一个茎-环结构区[6]。Rep由ORF1转录子在mRNA第417～799处的剪切位点剪接而成，含有178个氨基酸，分子质量为20.4 ku。RepC端的68个氨基酸来自不同的ORFs[7]。PCV2病毒的复制需要Rep和Rep蛋白互相作用共同启动，结合位点位于ORF1和ORF2之间的茎-环结构区[8]。

ORF2位于反义链方向，编码233或234个氨基酸的病毒衣壳蛋白（CP），亦称为结构蛋白（Cap）。CP上面存在着病毒的主要抗原决定簇，是PCV2病毒与细胞受体黏附的主要区域，也是研制PCV2病毒疫苗的首选区域。Cap蛋白N端1-41位为核定位信号肽序列，其中第12～18位和第34～41位氨基酸对Cap蛋白在细胞核的定位过程中起重要作用[9]。第65～87位，113～139位，163～183位，193～207位氨基酸4个区域与抗原免疫反应相关[10]。

Khayat等[11]进一步研究发现70位ASP、71位Met、77位Asn和78位Asp是第65～87位抗原免疫反应相关区域的关键残基；113位Glu、115位Asp和127位Asp是113～139位抗体免疫反应相关区域的抗体识别的重要位点；203位Glu、206位Ile和207位Tyr是193～207位区域的抗体识别位点。Trible等[12]鉴定了163～183位区域的与疾病相关的免疫功能表位，丙氨酸扫描发现Y-173、F-174、Q-175和K-179是重要的抗体识别位点。

ORF3重叠于ORF1负链内，编码105个氨基酸，方向与ORF2相同。Liu等[13]通过检测ORF3功能缺失病毒在PK-15细胞内的复制拷贝发现ORF3不参与病毒复制，但是参与激活caspase-8和caspase-3途径，在介导细胞凋亡中有重要作用。研究表明ORF3蛋白同Pirh2相互作用能够使肿瘤抑制因子p53蛋白的表达量升高，进而诱导细胞凋亡[14-15]。Liu[16]进一步试验发现，ORF3蛋白功能缺失体无法造成小鼠的微观病变，并且对CD4和CD8、CD8细胞的弱化功能减弱。同时ORF3蛋白免疫小鼠后血清中IL-4的质量浓度显著升高，IL-10、IL-12、IFN-gamma的质量浓度没有明显变化，说明ORF3蛋白在PCV2诱发的体液免疫中发挥着一定的作用[17]。

ORF4重叠于ORF3内，全长约180 bp，转录方向与ORF3相同但采用不同起始密码子[18]。李增魁等[19]体外表达ORF4蛋白发现其有一定的细胞毒性。He等[20]构建拯救出了PCV2-ORF4缺失体病毒（PCV2△），并和野生型病毒（wPCV2）分别感染细胞和小鼠。结果表明，PCV2△感染细胞后能够提高caspase-3、8、9的活性，证明ORF4与凋亡抑制相关。PCV2△感染的小鼠体内出现CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD8+T淋巴细胞严重减少，说明PCV2△比wPCV2具有更强的致病力，表示ORF4基因是PCV2致病的负调控基因。

ORF5基因全长180 nt，与ORF1转录方向相同。Lv等[21]对PCV2bORF5基因进行定点突变，发现其与病毒复制和细胞凋亡无关。通过构建真核表达载体表达ORF5基因蛋白研究其生物功能显示，绿色荧光蛋白（GFP）标记的ORF5蛋白集中于细胞内质网上，具有减弱蛋白酶体，延长细胞周期S期，抑制肺泡巨噬细胞生长的作用。

进一步研究发现ORF5能诱导内质网活化NF-КB信号，上调IL-6、IL-8和COX-2的表达。细胞蛋白GPNMB、CYP1A1、YNHAB、ZNF511和SRSF3通过酵母双杂交系统（yeast two-hybrid assay）与ORF5蛋白相互作用。

3 基因亚型分类

国际病毒分类学委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses ，ICTV）对种以下不进行分类，Grau-Roma等[22]基于不同PCV2全基因组序列错配比率（即遗传距离P）提出了一种PCV2全基因组分型方法，即当遗传距离p超过0.02时，认定为不同亚型。这种方法在病毒学上已经被广大学者广泛接受。Segalés等[23]对196份PCV2 ORF2序列的错配比率与其频率构建直方图发现，在不同遗传距离处有两个频率高峰，两个频率高峰之间，位于p=0.035处有一处频率低谷。因此，PCV2 ORF2序列的遗传距离超过0.035时即判定为不同基因亚型。应用这两种方法对GeneBank上的序列进行分析，均能得到3种相同的基因亚型。对于Wang等[24]对中国分离株进行系统发生树分析时，并没有应用以上两种方法，Cortey等[25]对Wang提交的序列比对后认为Wang提出的新的基因型PCV2d和PCV2e的命名不成立，它们应分别属于PCV2b和PCV2a两种亚型。Olvera等[26]按照上述方法将PCV2a细分为5个进化枝（p=0.015 8），命名为PCV群II A-E，PCV2b细分为3个进化枝（p=0.023 4），命名为PCV群I A-C。

4 分子差异与致病力

PCV2a基因组全长1 768 bp，PCV2b基因组全长1 767 bp，在核苷酸水平上有95%相同。PCV2a在1 487～1 473位为ACCAACAAAAT，PCV2b在1 486～1 472位为TCAAACCCCCG。氨基酸序列为86-TNKISI和86-SNPRSV[27]。目前尚无报道表明该段序列差异与病毒致病性或毒力相关。

PCV2a和PCV2b在全球范围内存在，2000年以前PCV2a为主要的致病基因亚型，2000年以后转变为PCV2b。但研究表明，单一的PCV2a或单一的PCV2b病毒在试验动物上不能很好的复制出相应的PWMS，需要与PRRSV等其他病原微生物混合感染才能达到预期效果。Cortey等[28]对西班牙PCV2a和PCV2b的历年检测频率进行了统计，认为PCVAD的爆发与PCV2a到PCV2b的基因亚型转化有关。Harding等[29]试验性的将PCV2a和PCV2b两两排列组合，按攻毒顺序分成2a/2a、2a/2b、2b/2a、2b/2b 4组，分别感染SPF猪，两次攻毒间隔一周，发现PCV2a和PCV2b无论以何种顺序组合都能复制出PCVAD。Khaiseb等[30]对发病和亚临床状态猪的组织进行原位杂交试验，发现发病猪的组织表现为细胞同时感染两种基因亚型；亚临床状态猪仅感染一种基因亚型，这进一步证明了PCV2a和PCV2b相互作用能够促进疾病的发生和发展。

5 展 望

猪圆环病毒的发现与发展仅仅几十年的时间，但已经成为世界范围内广泛存在的疾病。由于常见持续性消瘦、衰竭而亡，病程较长，只是偶然出现大规模爆发大量死亡的情况，因此，饲养管理人员及部分科研人员对该病不予重视。这不仅造成了大量的经济损失，养殖成本增高，也造成了PCV2病毒的传播与变异。现阶段对于PCV2的各开放阅读框的功能还未完全明了，致病机理和逃脱免疫的机制目前尚存争议，因此，对于PCV2基因各开放阅读框功能的研究可能对阐述PCV2的致病机理和免疫逃脱机制提供依据。

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