5个家系δβ地中海贫血的家系分析及产前诊断

杜丽 秦丹卿 王继成 郭浩 袁腾龙 王奕霞 张艳霞 梁驹卿 骆明勇 吴菁

5个家系δβ地中海贫血的家系分析及产前诊断

杜丽 秦丹卿 王继成 郭浩 袁腾龙 王奕霞 张艳霞 梁驹卿 骆明勇 吴菁★

目的 对5个δβ地中海贫血家系进行分析及产前诊断。 方法 采集家系成员外周血进行血细胞分析，应用毛细管电泳技术对血红蛋白进行分析，采用裂隙聚合酶链反应（Gap-PCR）以及PCR结合反向点杂交（PCR-RDB）方法对来自外周血及羊水、绒毛的 αβ珠蛋白进行基因突变鉴定。

结果 检测到中国型Gγ+（Aγδβ）0地中海贫血携带者5例，中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫复合β地贫导致的重型地中海贫血1例，3个胎儿为中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫复合β地贫。 结论 对高风险家庭进行产前诊断避免重型地贫患儿的出生，对于优生优育具有重要意义。

δβ地中海贫血；基因诊断；产前诊断

［KEY WORDS］δβ-thalassemia；Gene diagnosis；Prenatal diagnosis

β地中海贫血（β地贫）主要由β珠蛋白基因突变引起，少部分是由于β珠蛋白基因缺失导致。δβ地贫主要是指累及δ珠蛋白基因和β珠蛋白基因在内的缺失，部分缺失类型包括Aγ、Gγ和ε珠蛋白基因的缺失。我国最常见的δβ地贫为中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫，此类缺失突变与β地贫点突变的双重杂合子可导致中间型或重型β地中海贫血［1-2］。我们对5个中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫家系进行分析，并进行了产前诊断，报告如下。

1 对象与方法

1.1 对象

2013年1月 ～2014年4月在我院医学遗传中心就诊并进行产前诊断的5个家系。

1.1.1 家系1

孕妇就诊时孕22+周，外院检测地贫基因型βCD41-42/βN，丈夫外院常规αβ地贫基因检测未见异常，自述2011年顺产一女孩，1岁因重度贫血夭折，要求进行产前诊断。对其丈夫明确诊断后羊水穿刺进行地贫产前基因诊断。

1.1.2 家系2

孕妇就诊时孕12+周，2010年顺产一女孩，外院诊断为重型β地中海贫血，基因型为βCD17/βCD17（后我院诊断基因型为Gγ+（Aγδβ）0/ βCD17），孕妇本人外院常规αβ地贫基因检测未见异常，丈夫外院检测地贫基因型为βCD17/βN，要求进行产前诊断。对孕妇本人及重型地贫患儿明确诊断后绒毛穿刺进行地贫产前基因诊断。

1.1.3 家系3

孕妇就诊时孕20+周，外院检测地贫基因βCD41-42/βN，丈夫外院地贫筛查阳性，常规αβ地贫基因检测未见异常，要求对丈夫进行地贫基因诊断。对其丈夫明确诊断后羊水穿刺进行地贫产前基因诊断。

1.1.4 家系4

孕妇就诊时孕18+周，外院检测地贫基因型βCD41-42/βN，丈夫外院地贫筛查阳性，常规αβ地贫基因检测未见异常，要求对丈夫进行地贫基因诊断。对其丈夫明确诊断后羊水穿刺进行地贫产前基因诊断。

1.1.5 家系5

孕妇就诊时孕20+周，2009年顺产一女孩，数月因重度贫血夭折，孕妇本人外院检测地贫基因型为βCD17/βN，丈夫外院地贫筛查阳性，常规αβ地贫基因检测未见异常，要求对丈夫进行地贫基因诊断。对其丈夫明确诊断后羊水穿刺进行地贫产前基因诊断。

1.2 方法

1.2.1 血液学分析

用EDTA抗凝管采集5家系成员外周血2 mL，采用迈瑞BC-2000血液分析仪进行红细胞参数分析。用ACD抗凝管采集该5家系成员外周血2 mL，采用Sebia capillarys 2全自动毛细管电泳仪进行血红蛋白分析。

1.2.2 分子诊断

1.2.2.1 DNA提取 用ACD抗凝管采集5家系

成员外周血 2 mL进行αβ地贫基因诊断及 δβ地贫基因诊断。用无菌羊水管采集羊水 15 mL或者绒毛6支进行产前基因诊断。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，按试剂盒说明书提取步骤进行DNA的提取。应用复合荧光标记短串联重复序列（short tandem of repeat，STR）方法排除羊水及绒毛样本母体组织的污染［3］，排除母体组织污染之后才进行产前基因诊断。

1.2.2.2 α地贫基因检测 采用单管四重PCR基因诊断技术检测--SEA、-α3.7、-α4.23种 α珠蛋白基因常见缺失型。采用裂隙聚合酶链反应结合反向点杂交（polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB）方法进行点突变的检测，检测范围包括αCS、αQS、αWS3种点突变。基因诊断试剂由亚能生物技术有限公司（深圳）提供。

1.2.2.3 β地贫基因突变检测 常规 β地贫基因检测采用PCR-RDB方法，基因诊断试剂盒由亚能生物技术有限公司（深圳）提供，可同时检测中国人中常见的17种β-地贫基因突变：CD41-42 （-TCTT），IVS2-654（C→T），-28（A→G），CD71-72（+A），CD17（A→T），-29（A→G），CD43（G→T），-30（T→C），-32（C→A），βE（GAG→T），CD14-15（+G），CD31（-C），CD27-28（+C），IVS1-1 （G→T，G→A），IVS1-5（G→C），Cap+1（A→C），Initiation condon（ATG→AGG）。其中，IVS1-1 （G→T，G→A），IVS1-5（G→C），Cap+1（A→C），Initiation condon（ATG→AGG）无正常参照点。

1.2.2.4 中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫及东南亚型HPFH缺失检测 采用裂隙聚合酶链反应（gap-PCR）方法检测中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫缺失，引物设计及反应条件参考文献［4］，Gγ+（Aγδβ）0缺失共用上游引物：CCAGCCTCATGGTAGCAGA ATC，Gγ+（Aγδβ）0缺失突变下游引物：TGGTATC TGCAGCAGTTGCC，Gγ+（Aγδβ）0缺失正常内对照下游引物：GTGATTGTTGAGTTG CAAGATCG，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系购自大连宝生物工程有限公司，PCR扩增反应条件为95℃预变性5 min；94℃ 45 s→ 60 ℃ 30 s→ 72℃ 30 s，35个循环；72℃ 延伸7 min。

2 结果

2.1 5家系成员的血液学指标分析及基因诊断结果

血细胞分析提示 5例中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫杂合子血红蛋白均正常，平均红细胞容积（meancorpuscular volume，MCV）降低。血红蛋白分析提示5例中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫杂合子血红蛋白A2 （HbA2）稍低或正常，血红蛋白F（hemoglobin F，HbF）明显升高；1例重型地贫患儿 （基因型Gγ+（Aγδβ）0/βCD17）血红蛋白几乎全部为HbF。5家系成员的血液学指标分析及基因诊断结果、产前诊断结果详见表1，图1-图5。

表15 家系成员血细胞分析、血红蛋白分析及基因诊断结果Table 1 Hematological and gene diagnosis data of the 5 families

图1 家系1父母及胎儿中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫检测电泳图及杂交膜条图

图2 家系2父母、患儿及胎儿中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫检测电泳图及杂交膜条图

图3 家系3父母及胎儿中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫检测电泳图及杂交膜条图

2.2 产前诊断结果及妊娠结局

在进行产前诊断的这5个家系中，3个胎儿为中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫复合β地贫。经过充分的遗传咨询，胎儿父母均要求放弃胎儿，均于诊断后的3周内进行引产。

3 讨论

δβ地贫以γ-珠蛋白基因持续表达，出生后HbF持续增高（5%～20%）为特征。δβ-地贫杂合子临床表现为无贫血或轻度贫血，当合并β地贫时，可有中度或重度贫血，肝脾大，需要依赖规律输血，类似于中间型或重型β地贫。而纯合子的临床表现也与中间型或重型β地贫相同。δβ地贫分子基础为累及δ珠蛋白基因和β珠蛋白基因在内的β珠蛋白基因簇的大片段缺失，目前在世界不同种族至少发现了46种此类突变，中国人群最常见的缺失类型为中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫，中国型Gγ+（Aγδβ）0地中海贫血的基因缺失范围包括 β珠蛋白基因簇Aγ、ψβ、δ和 β基因以及3′-HS-1区域，缺失长度为78.9 kb［1-2，5-7］。

图4 家系4父母及胎儿中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫检测电泳图及杂交膜条图

图5 家系5父母及胎儿中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫检测电泳图及杂交膜条图

中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫杂合子临床表现为无贫血或者轻度贫血症状，HbA2正常或下降，HbF为10%～20%。本研究5个家系中的5个中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫杂合子临床表现无贫血 （血红蛋白 118～153 g/L），MCV降低 （66.2～71.3 fL），HbA2稍低或正常 （2.4%～2.8%），HbF明显升高（14.2%～16.2%），与相关文献报道相似［2，7-8］。当中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫复合 β地贫时临床表现类似于中间型或者重型β地贫。在我们研究的5个家系中，2个家系的两个孩子分别在数月和1岁因重度贫血夭折（高度可疑为中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫复合β地贫，未能证实），观察到的1例中国型Gγ+（Aγδβ）0地贫复合 β地贫 （Gγ+（Aγδβ）0/ βCD17）患儿表现为重度贫血（血红蛋白54 g/L），MCV降低 （63fL），血红蛋白几乎全部为 HbF （99.6%），无血红蛋白A。

在广东、广西等地贫高发区，临床医生要重视δβ地贫。当进行地贫筛查时，如发现MCV降低，HbA2未见明显异常而HbF明显增高时，或者夫妻双方基因诊断结果与重型地贫患儿基因诊断结果不符合时，应考虑存在δβ地贫的可能。当夫妇双方分别为δβ地贫和β地贫杂合子时，应给予充分的遗传咨询和建议产前诊断，以免重型地贫患儿的出生。本研究通过5个δβ地贫家系分析和产前诊断病例的分享，为δβ地贫的遗传咨询、基因诊断和产前诊断提供一定的依据和指导。

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Analysis and prenatal diagnosis of 5 families with δβ-thalassemia

DU Li，QIN Danqing，WANG Jicheng，GUO Hao，YUAN Tenglong，WANG Yixia，ZHANG Yanxia，LIANG Juqing，LUO Mingyong，WU Jing★
（Medical Genetics Center， Key Laboratory of Metabolic and Genetic Disease in Women and Children，Guangdong Women and Children Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，510010）

Objective To analysis 5 families with δβ-thalassemia and carry out the prenatal diagnosis.Methods Peripheral blood of the family members was collected.The whole blood cell analysis，capillary zone electrophoresis（CZE） were performed.αβ globin gene mutations were identified from peripheral blood，amniotic fluid and chorionic villus samples by Gap-PCR and polymerase chain reactionreverse dot blot（PCR-RDB）assay.Results 5 carriers of ChineseGγ+（Aγδβ）0-thalassemia and 1 case of severe anemia were detected.There were 3 cases of compound heterozygotes of ChineseGγ+（Aγδβ）0-thalassemia with β-thalassemia from 5 fetuses.Conclusions Clinicians should pay close attention to those who with reduced MCV and obvious increased Hb F.Compound heterozygote of δβ-thalassemia with β-thalassemia may lead to severe anemia.Prenatal diagnosis is very important for high-risk families.

广东省科技计划（2013B022000019）；广东省医学科学技术研究基金（A2014094）

广东省妇幼保健院医学遗传中心，广东省妇幼代谢与遗传病重点实验室，广东，广州 510010

吴菁，E-mail：singhwu@126.com