橡胶链格孢叶斑病病原菌生物学特性研究

刘一贤等

摘要：对由橡胶链格孢（Alternaria heveae）引起的橡胶叶斑病病原菌的生物学特性进行初步研究，结果表明，菌丝最适生长温度为30 ℃，最适生长pH为7～8，致死温度为52 ℃处理10 min；该病原菌能有效利用多种碳源和氮源，碳源以乳糖和鼠李糖利用率最高，牛肉浸膏和酵母浸膏为最适氮源；不同的光照条件对菌丝生长有影响，在24 h光照条件下更有利于菌丝生长。

关键词：橡胶树；Alternaria heveae；生物学特性

中图分类号： S432.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4195-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.022

天然橡胶和钢铁、煤炭、石油并称为四大工业原料，并且是其中惟一的可再生资源。天然橡胶的用途十分广泛，尤其是对于重要工业领域如航天航空、重型汽车制造等行业，天然橡胶仍属于不可替代性资源。斯里兰卡曾报道了超过60种侵染橡胶的病原菌[1]。链格孢属（Alternaria Nees）是经济上重要的真菌属之一。大多数种类兼性寄生于植物上，引起多种经济植物病害，造成田间和产后损失[2]。有的小孢子种链格孢能感染人和动物引起皮癣等疾病[3，4]。1947年在墨西哥首次报道了由链格孢属（Alternaria sp.）引起的橡胶叶斑病[5]。2006年在印度报道了由A. alternata引起的橡胶叶斑病，并采用RAPD和RFLP 2种方法分析了26株A. alternata之间的遗传差异[6]。2013年本研究小组在云南河口植胶区发现一种新的橡胶叶受害症状，受害叶片上有许多黑色、圆形、点状病斑，病斑直径为0.1～0.4 mm，稍凹陷，病斑周围有一黄色晕圈。与尖孢炭疽菌引起的症状很相似，但尖孢炭疽菌为害橡胶叶后在受害叶下形成点状的突起。经形态和分子鉴定该病病原为橡胶链格孢（A. heveae），为我国橡胶树一种新病害[7]。在对云南垦区的调查中发现多个植胶区均有该病原菌引起的橡胶叶斑病，已造成一定面积的危害，对橡胶产业的健康发展形成潜在威胁。因此对于橡胶链格孢叶斑病菌生物学特性的研究对指导该病害的防治至关重要。

迄今，国内还没有对橡胶链格孢引起的橡胶叶斑病的相关研究报道，对病原菌生物学特性的研究还处于空白。本研究对橡胶链格孢生物学特性进行了系统研究，为该病害的进一步深入研究及防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株来源：橡胶树链格孢叶斑病菌采自云南省河口热带作物科学研究所苗圃，由云南省热带作物科学研究所分离、鉴定并保存。

供试培养基：PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，去离子水 1 000 mL）；Czapek 培养基（NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖20 g）

1.2 方法

1.2.1 温度对菌丝生长的影响 将病原菌菌株接种到PDA平板上进行活化，培养3～4 d后，用直径为5 mm 的打孔器在病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼接种到PDA培养基上，分别置于10、15、20、22、24、26、28、30、35、40 ℃共10个温度下培养，每个处理重复3次，培养5 d后， 用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.2 pH对菌丝生长的影响 将冷却至60 ℃左右的PDA培养基，用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH溶液分别调节pH为3、4、5、6、7、8、9，制成PDA平板，用直径为5 mm 的打孔器在病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼接种到不同pH的平板上，每个处理重复3次，培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.3 病原菌菌丝的致死温度 将病原菌菌株接种到PDA平板上进行活化，培养3～4 d后，在菌落表面滴加2 mL无菌水，用无菌棉棒将菌落表面菌丝磨碎，取菌液置于已灭菌的玻璃试管中。于40、45、50、52、54、56、58、60、65 ℃恒温水浴锅中处理10 min，分别取0.2 mL不同温度处理的菌液涂板于PDA平板培养基上，以一支在室温中放置的试管作为对照，每个处理重复3次，在28 ℃培养箱中培养4 d后观察菌落生长情况。

1.2.4 碳源对菌丝生长的影响 以葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、山梨糖、甘露糖、鼠李糖、甘油、木糖等11种作为碳源，代替Czapek培养基中的蔗糖，配制不同碳源培养基，用直径为5 mm 的打孔器在病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼接种到不同碳源的培养基平板上，每个处理重复3次，培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.5 氮源对菌丝生长的影响 以L-天门冬酰胺、色氨酸、胱氨酸、L-丙氨酸、酪氨酸、L-精氨酸、甘氨酸、酵母浸膏、牛肉浸膏、尿素、硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、亚硝酸钠等14种作为氮源，代替Czapek培养基中的硝酸钠，配制不同氮源培养基，用直径为5 mm的打孔器在病原菌菌落边缘打取菌饼，将菌饼接种到不同氮源的培养基平板上，每个处理重复3次，培养5 d后，用十字交叉法测量菌落直径。

1.2.6 光照对病原菌生长的影响 设置24 h黑暗、24 h光照（日光灯15 W）、12 h黑暗/12 h光照（日光灯15 W），24 h黑光灯（黑光灯15 W），4种光照条件。将病原菌接种到PDA培养基上，分别置于4种光照条件下，每个处理重复3次，观察菌落生长情况。

1.2.7 数据统计 采用SAS9.2数据分析软件进行Duncan氏新复极差法检验。

2.2 结果与分析

2.2.1 温度对菌丝生长的影响 由图1可看出，病原菌在10～40 ℃之间都能生长，适宜温度范围为24～30 ℃，培养5 d后菌落直径在5.05～7.32 cm之间，最适温度为30 ℃，培养5 d后菌落直径达到7.32 cm。病原菌菌丝在超过30 ℃时对温度比较敏感，低于10 ℃或高于40 ℃时菌丝停止生长。

2.2.2 pH对菌丝生长的影响 病原菌菌丝在pH3～9时均能生长，在pH5～9均有较好长势，最适pH为7～8，培养5 d后菌落直径达到5.90 cm。病原菌菌丝对酸碱的适宜范围比较广，但更适宜在弱碱性环境下生长，强酸性环境明显抑制菌丝生长（图2）。

2.2.3 病原菌菌丝的致死温度 以在室温下处理作为对照，设置了9个温度对病原菌菌丝进行处理，在40、45、50 ℃处理下菌丝均能形成新菌落，在52 ℃处理下不能形成新菌落，说明病原菌菌丝的致死温度为52 ℃处理10 min（表1）。

2.2.4 不同碳源对菌丝生长的影响 对11种不同碳源进行比较之后发现病原菌对乳糖和鼠李糖利用最好，菌丝生长较快，培养5 d后菌落直径达到5.83 cm和5.63 cm。其次是对可溶性淀粉利用较好，菌落直径为5.30 cm，在含有葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘油的培养基上病原菌长势较慢，菌落直径为3.4～3.7 cm（图3）。

2.2.5 不同氮源对菌丝生长的影响 由图4可知，在含有14种不同氮源的培养基上，病原菌在含牛肉浸膏和酵母浸膏的培养基上长势最快，对氮源的利用率最高，培养5 d后菌落直径分别达到5.17 cm和5.57 cm。在含L-天门冬酰胺、甘氨酸、NaNO3、L-丙氨酸、NH4Cl、色氨酸的培养基上病原菌长势明显减弱，菌落直径无显著性差异。尿素、酪氨酸、L-精氨酸、胱氨酸对病原菌有明显的抑制作用，菌落直径仅为0.8～1.8 cm。说明病原菌对有机氮源和无机氮源都能利用，但对有机氮源的利用率更高。

2.1.6 光照对病原菌生长的影响 设置了4种光照条件对病原菌进行处理（表2），在24 h光照条件下更有利于菌丝生长，并且在光照条件下有利于产生色素。在光暗交替的条件下更有利于孢子产生，光暗交替和黑光照射对菌丝的影响无明显差异，黑暗条件下不利于菌丝生长。

3 小结与讨论

根据本研究结果可知，橡胶树链格孢菌在10～40 ℃之间均能生长，最适生长温度为30 ℃，橡胶链格孢菌在超过35 ℃高温下亦可生长，这与橡胶树生长气候条件相符。小麦链格孢（A. triticina）菌落生长的温度范围为5～35 ℃，说明不同种的链格孢生长的温度范围有所差异，与田间发病情况有关[8]。橡胶链格孢对酸碱的适应范围比较广，菌丝在pH3～9范围内均能生长，而烟草赤星病菌（A. alternata）在pH低于4的环境下不能生长，小麦链格孢在pH低于3.5的环境下不能生长，说明橡胶链格孢对酸性环境的适应能力较强，具有较强的抗逆性[8，9]。菌丝在52 ℃条件下处理10 min停止生长，其菌丝致死温度略高于其他种的链格孢，这是由于其对高温的适应能力更强。对于橡胶链格孢的防治，可以根据田间的气候特点、温度、湿度、土壤酸碱度等特征掌握其发生流行的规律，从而更好的防治该病害。

通过对11种不同碳源进行比较发现，病原菌对乳糖和鼠李糖利用最好，对14种氮源比较发现，病原菌在含牛肉浸膏和酵母浸膏的培养基上长势最好，对氮源的利用率最高。不同种的链格孢对碳源和氮源的利用各不相同，席兴文等[10]提出不同种链格孢对碳源、氮源的利用及培养特征可作为分类鉴定的依据。而对于橡胶链格孢的防治可采用其利用效率较低的碳源、氮源开发新农药。

链格孢属真菌是引起植物病害的重要真菌类群之一，广泛寄生于农作物上引起病害[11]。该类真菌引起作物发病的机制主要是由其代谢产生的毒素导致的[12，13]。近年来国内外利用微生物制剂、植物源制剂及诱抗剂等对链格孢属真菌引起的植物病害进行生物防治，取得了一定的效果。例如日本研发的多氧霉素和我国研发的多抗霉素对烟草赤星病、苹果斑点落叶病具有显著的效果。王东昌等[14]从枯草芽孢杆菌发酵液中提取的一种抗菌素对链格孢引起的苹果霉心病菌也具有良好的抑菌效果。因此，对于橡胶链格孢叶斑病的防治在采取传统化学药剂防治的同时，可积极研发有效的微生物制剂、农用抗生素等新型农药。

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