前肢畸形WHBE兔前肢骨密度检测及降钙素、骨钙素蛋白表达

陈方明, 林　琳, 蔡月琴, 陈　诚, 陈民利

（浙江中医药大学动物实验研究中心, 杭州　310053）

前肢畸形WHBE兔前肢骨密度检测及降钙素、骨钙素蛋白表达

陈方明, 林琳, 蔡月琴, 陈诚, 陈民利

（浙江中医药大学动物实验研究中心, 杭州310053）

目的观察前肢畸形的WHBE （FMWHBE） 兔前肢骨密度和降钙素（CT）、骨钙素（又称γ-羧基谷氨酸蛋白, BGP）蛋白表达水平，探讨前肢畸形的可能成因及作为骨生物力学研究的模型动物的可能性。方法分别选取1、2、3、4月龄FMWHBE兔、WHBE兔和日本大耳白兔，每个月龄阶段各6只。所有实验兔称体质量后耳动脉取血检测血清CT、BGP含量，用小动物成像系统测量前肢肱骨、桡骨、尺骨近心端、中段、远心端骨密度，并经脱钙后进行CT、BGP免疫组织化学染色观察。结果各组实验兔各月龄体质量无显著差异。FMWHBE兔肱骨1月龄全段和2月龄近心端、中段及3月龄肱骨远心端，桡骨1月龄中段和远心端及2、3月龄的远心端，尺骨1、2月龄全段及3月龄远心端骨密度均显著低于WHBE兔和日本大耳白兔组（P＜0.05或P＜0.01）。1月龄FMWHBE兔血清CT、BGP含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），2月龄BGP显著高于日本大耳白兔（P＜0.01），3月龄CT 显著高于WHBE兔（P＜0.05）。CT、BGP免疫组织化学染色显示, FMWHBE兔CT表达阳性部位较少，阳性较弱，BGP表达稍弱于WHBE兔和日本大耳白兔。结论FMWHBE兔发生前肢畸形和骨密度变化可能与其生长发育过程中趴卧姿态导致的前肢骨特殊应力及CT、BGP的表达特点有关。

前肢畸形； WHBE兔； 骨密度； 降钙素； 骨钙素

WHBE兔（White hair & black eyes rabbit, WHBE）,是本中心从日本大耳白兔中发现的毛色为白色、眼睛为黑色的实验兔，现已近交育成封闭群实验兔，又名日本大耳白兔黑眼系。在育种过程中, 有部分幼年WHBE兔自发前肢畸形, 表现为1、2月龄开始前肢外展, 无法内收直立, 足部无力支撑, 仅靠前肢整体着地支撑体质量, 呈趴卧姿态。本实验检测了1、2、3、4月龄的前肢畸形WHBE兔（FMWHBE）肱骨、桡骨、尺骨近心端、中段和远心端骨密度（bone mineral density, BMD），对FMWHBE兔血清和前肢肱骨、桡骨、尺骨降钙素（CT）、骨钙素（称γ-羧基谷氨酸蛋白，BGP）蛋白表水平达进行检测,并与同期日本大耳白兔、正常WHBE兔进行对比，探讨WHBE兔自发前肢畸形的可能成因，并为探讨FMWHBE兔能否作为骨质疏松症等骨生物力学研究的模型动物提供一定依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

分别选取1、2、3、4月龄FMWHBE兔、WHBE兔和日本大耳白兔，每月龄阶段各6只，共72只。选取实验兔体质量为1月龄： 1.0～1.4 kg，2月龄： 1.3～2.1 kg，3月龄： 1.9～2.3 kg，4月龄：2.3～2.7 kg，来源于新昌县大市聚镇欣健兔场［SCXK（浙）2009-0042］； 饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心普通级实验室［SYXK（浙）2008-0116］，饲料钙、总磷含量分别为1.5%、0.8%，符合GB 14924.3-2010标准。饲养室温度22±2℃, 相对湿度50%±5%, 12h/12h明暗交替, 光照强度150 lx。1.2主要仪器和试剂

Kodak Image Station小动物成像系统、Thermo Electron Corporation 酶标仪、STP120脱水机、AP280-2包埋机、Leica切片机、Nikon eclipse 80i显微镜、Zeiss Image System图像分析系等。血清CT ELISA试剂盒，批号： R700291L/T、BGP ELISA试剂盒，批号： R907871L/T； 进口脱钙液，批号： 20999, 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；一抗： Anti-Calcitonin antibody （CT），兔单克隆抗体，批号： GR50372-1, abcam公司； Anti-Osteocalcin antibody（BGP）, 小鼠单克隆抗体, 批号： GR178730-1, abcam公司；二抗：Super Picture 3rd Gen IHC Detection Kit，批号：1289835A，Invitrogen公司。1.3实验方法

将FMWHBE、WHBE兔组和日本大耳白兔组（JPW）各月龄实验兔称体质量并记录，耳动脉取血5 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清，用ELISA法检测血清CT、BGP含量； 体积分数3%戊巴比妥钠1 mL/kg麻醉处死各组实验兔，立即取前肢，用小动物成像系统X射线成像后测量肱骨、桡骨、尺骨近心端、中段、远心端骨密度。分离前肢肌肉后用体积分数10%中性甲醛固定, 快速脱钙1周后进行包埋、切片、免疫组织化学染色。免疫组织化学两步法染色方法： 切片脱蜡至水, 蒸馏水洗2 min； 置枸橼酸盐缓冲液中高压热修复1 min；体积分数3% H2O2溶液灭活过氧化物酶10 min； PBS 洗5 min×3次； 滴加一抗, 稀释浓度均为1∶100, 37 ℃孵育60 min； PBS洗5 min×3次； 滴加二抗, 37 ℃孵育15 min； PBS洗5 min×3次； DAB显色2 min,复染、透明后封片。结果判断： 阳性表达呈黄色或棕黄色。

骨质疏松判断标准： Kodak Image Station自带图像分析软件对X光成像后的前肢骨进行骨密度测量。根据文献，采用同龄正常动物BMD值作为对照，以BMD统计学分析结果显著降低作为骨质疏松症的判断标准［1-3］。

1.4统计学处理

2　结果

2.1实验兔前肢X射线成像

X射线成像见FMWHBE兔前肢桡骨、尺骨畸形（图1）。

2.2实验兔不同月龄体质量

各组实验兔1、2、3、4月龄体质量未见明显差异（表1）。

2.3实验兔不同月龄前肢肱骨、桡骨、尺骨骨密度

图1　三种实验兔前肢X射线成像（1月龄）Figure 1　ray image of the fore limb in rabbits （1 month old）

表 1　实验兔不同月龄体质量Table 1　Changes of the body weight in rabbits at different ages　　　　　　　　　　　　　　kg

1月龄FMWHBE兔肱骨近心端、中段、远心端骨密度均显著低于WHBE兔和日本大耳白兔组（P＜0.05或P＜0.01），FMWHBE兔2月龄近心端、中段和3月龄肱骨远心端骨密度显著低于WHBE兔和日本大耳白兔组（P＜0.05或P＜0.01）； WHBE兔2月龄肱骨远心端和4月龄肱骨中段骨密度显著高于日本大耳白兔组（P＜0.05）（表2）。

1月龄FMWHBE兔桡骨中段和远心端、2、3月龄的远心端骨密度均显著低于WHBE兔和日本大耳白兔组（P＜0.05或P＜0.01）； WHBE兔桡骨3月龄的中段和4月龄的近心端骨密度显著低于日本大耳白兔组（P＜0.05或P＜0.01）（表3）。

表4结果显示： 1、2月龄FMWHBE兔尺骨近心端、中段、远心端及3月龄远心端骨密度均显著低于WHBE兔和日本大耳白兔组（P＜0.05或P＜0.01）；4月龄WHBE兔尺骨远心端骨密度显著高于WHBE兔组（P＜0.05）（表4）。

2.4实验兔血清CT、BGP水平

1月龄FMWHBE兔血清CT显著低于日本大耳白兔组和WHBE组（P＜0.05），BGP显著低于WHBE组（P＜0.05），2月龄FMWHBE兔血清BGP显著高于日本大耳白兔组（P＜0.05），3月龄CT显著高于WHBE兔组（P＜0.05）（表5）。

2.5实验兔前肢肱骨、桡骨、尺骨CT、BGP蛋白表达情况

各组实验兔前肢肱骨、桡骨、尺骨均可见CT表达，阳性物质呈黄色或淡黄色，骨小管周围及新生骨组织可见大量阳性物质高表达。与WHBE兔和日本大耳白兔比较，FMWHBE兔前肢肱骨、桡骨、尺骨CT表达阳性部位较少，面积较小，阳性较弱（图2A、B、C）。各组实验兔前肢肱骨、桡骨、尺骨均可见BGP表达，阳性物质呈黄色或淡黄色，主要分布于骨小管周围及新生骨组织，后者可见大量阳性物质表达。FMWHBE兔前肢肱骨、桡骨、尺骨BGP表达阳性部位较少，局部面积较小，阳性稍弱于WHBE兔和日本大耳白兔（图3A、B、C）。

表 2　实验兔不同月龄前肢肱骨骨密度Table 2　The results of bone mineral density of fore humerus in rabbits at different ages　　　　　g/cm2

表 3　实验兔不同月龄前肢桡骨骨密度Table 3　The results of bone mineral density of fore radius in rabbits at different ages　　　　　　g/cm2

表 4　实验兔不同月龄前肢尺骨骨密度结果Table 4　The results of bone mineral density of fore ulna in rabbits at different ages　　　　　　　g/cm2

表 5　实验兔不同月龄血清CT、BGP水平Table 5　Changes of the levels of serum CT and BGP in rabbits at different ages　　　　　　　　mol/L

3　讨论

根据Wolff定律，骨以最优的形式适应其力学环境，即骨质中的骨细胞能够感应局部的应力，并据此调整细胞的成骨、吸收作用［4］。骨是力学敏感性组织，力学载荷作用于骨组织，根据载荷不同调节其骨量、结构及力学特征［5］。FMWHBE兔各月龄体质量与WHBE兔和日本大耳白兔未见明显差异，表明其四肢负重总和未见差异。FMWHBE 兔1、2月龄前肢肱骨、桡骨、尺骨近心端、中段、远心端都发生不同程度骨密度降低，存在一定程度的骨质疏松, 而4月龄FMWHBE兔除桡骨近心端骨密度显著降低外其他各月龄骨密度与WHBE兔和日本大耳白兔未见有明显差异。FMWHBE兔生长发育过程中1、2月龄前肢趴卧，其前肢尺骨、桡骨、肱骨应力和应变可能异常，结合病理学检查结果其局部新生骨组织较少, 提示FMWHBE 兔1、2月龄骨密度降低可能和其生长发育过程中1、2月龄逐渐形成的趴卧姿态有关，而后期随着体质量增加，其前肢应力和应变加大，根据力学调控体系理论，前肢骨骨量增加以适应前肢载荷。

CT 通过直接抑制破骨细胞的活性和增加尿中的钙、磷排泄降低血钙和血磷，使破骨细胞迅速停止代谢。CT可以促进骨的形成和矿化过程，有研究认为CT具有抑制成骨细胞凋亡的作用，CT治疗糖皮质激素诱发的骨质疏松，其作用机制部分是由于抑制成骨细胞和骨细胞凋亡的结果［6］。BGP，是成骨细胞合成和分泌的一种激素样多肽，具有骨代谢调节激素作用，是反映骨更新状态和骨形成的一种特异性指标［7,8］。BGP可与钙和羟磷灰石结合而使骨矿化，具有维持骨的正常矿化速率、抑制异常羟磷灰石结晶形成的作用。BGP大多沉积于骨基质， 三分之一进入血液循环。因此血清中骨钙素浓度可特异性地反映成骨细胞的活性，用于判断成骨细胞活性受抑制的程度，是骨形成功能的良好标志。由于在骨吸收过程中，基质中的骨钙素又可释放到血液，因此，骨钙素是评价骨形成和骨转换率的特异性指标。在骨质合成时，血清骨钙素可以增高, 若骨钙素水平下降，则提示成骨细胞活性下降及骨转移率降低［9］。本实验FMWHBE兔1月龄血清CT和BGP均显著降低，而2月龄BGP、 3月龄CT显著升高，组织免疫组织化学结果显示CT表达较WHBE兔和JPW兔弱，BGP阳性表达亦较低，提示FMWHBE兔1月龄骨形成较慢。结合1至4月龄骨密度变化，FMWHBE兔1、2月龄骨密度较低而4月龄骨密度增加可能与CT和BGP的特异性表达有关。

A： FMWHBE肱骨；　B： FMWHBE桡骨；　C： FMWHBE尺骨；　D： WHBE肱骨；　E： WHBE桡骨；　F： WHBE尺骨；　G： JPW肱骨；　H： JPW桡骨；　I： JPW尺骨A： FMWHBE humerus； B： FMWHBE radius； C： FMWHBE ulna；　D： WHBE humerus；　E： WHBE radius；　F： WHBE ulna；G： JPW humerus； H： JPW radius； I： JPW ulna

综上所述, FMWHBE兔前肢畸形和骨密度变化可能与其生长发育过程中趴卧姿态导致的前肢骨特殊应力及CT、BGP的表达特点有关。FMWHBE兔可作为潜在骨生物力学模型动物进一步研究。

［1］Liu X, Lei W, Wu Z, et al. Effects of glucocorticoid on BMD, micro-architecture and biomechanics of cancellous and cortical bone mass in OVX rabbits［J］. Med Eng Phys, 2012, 34（1）：2-8.

［2］郭磊. 恒古骨伤愈合剂对骨质疏松兔力学及微结构影响的基础研究［D］. 昆明： 昆明医科大学, 2014.

［3］方忠, 杨琴, 李锋, 等.去势法兔骨质疏松模型建立的探讨［J］. 中国骨质疏松杂志, 2005, 11（2）：202- 205.

［4］Wolff J. Das gesetz der Transformation de Knochen［M］. Berlin：Springer-Verlag,1892.

［5］Van C Mow, Rih Huiskes. 骨科生物力学暨力学生物学［M］.汤婷婷等译. 济南：山东科学出版社, 2009：138-145.

［6］Plotkin LI, Weinstein RS, Parfitt AM, et al. Prevention of osteocyte and osteoblast apoptosis by bisphosphonates and calcitonin［J］. J Clin Invest,1999,104 （10）：1363.

［7］王月, 吕志伟, 张天宇. 辛伐他汀对骨髓基质干细胞成骨分化晚期骨钙素表达的影响［J］. 中国煤炭工业医学杂志, 2014, 17（7）：1135-1137.

［8］Power MJ, FottellPF. Osteocalcin diagnostic methods and clinical applications［J］. Crit Rev Clin Lab Sci,1991, 28：287-335.

［9］张玲莉, 陈炳霖, 邹军. 运动影响骨转换, 促进或抑制骨细胞、破骨细胞的发育和活性［J］.中国组织工程研究, 2014, 18（42）：6838-6843.

The Forelimb Bone Mineral Density and Expression of Calcitonin and Osteocalcin in Forelimb Malformed White Hair & Black Eyes Rabbits

CHEN Fang-ming, LIN Lin, CAI Yue-qin, CHEN Cheng, CHEN Min-li
（The Research Center of Animal Experiment， Zhejiang Chinese Medicine University， Hangzhou 310053， China）

ObjectiveTo observe bone mineral density and expression level of calcitonin （CT）, osteocalcin （also named bone gla protein, BGP） proteins in forelimb malformation WHBE rabbits （FMWHBE） and to explore possible cause of forelimb malformation and possibility to be an animal model for bone biomechanical studies. MethodFMWHBE rabbits, WHBE rabbits and Japan white rabbits （JW） at 1, 2, 3 and 4 months of age were selected with six rabbits for each age. Contents of CT, BGP in serum were detected after body weighing and a small animal imaging system was used to measuring bone mineral density of proximal end, middle end and telecentric end in forelimb humerus, radius and ulna. CT and BGP immunohistochemical staining were used for pathological observation after decalcification. ResultNo significant difference of body weights of each month old was observed among all groups. Bone mineral density of whole length in 1 month old and proximal end, middle end in 2 months old and telecentric end in 3 months old of humerus, middle end and telecentric end in 1 month and telecentric end in 2 and 3 months old of radius and whole length in 1 and 2 months old and telecentric end in 3 months old of ulna in FMWHBE rabbits were notably lower than that in WHBE and JW rabbits （P＜0.05 or P＜0.01）. CT and BGP contents in serum of 1 month old FMWHBE were notably decreased （P＜0.05 or P＜0.01）. BGP level in 2 months old was obviously higher than that of in JW rabbits （P＜0.01）. CT level in 3 month olds was notably higher than that in WHBE rabbits （P＜0.05）. Immunohistochemical staining of CT, BGP showed that positive parts of CT expression in FMWHBE rabbit was less and weaker, and expression of BGP in FMWHBE rabbits was slightly weaker than that in JW rabbits and WHBE rabbits. ConclusionForelimb malformation formation and bone mineral density changes in FMWHBE rabbits may be related with the special stress in forelimb bones and expression character of CT and BGP induced by lying posture during growth.

Forelimb malformed； WHBE rabbits； Bone mineral density； Calcitonin （CT）；Osteocalcin （BGP）

Q95-33

A

1674-5817（2015）05-0383-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.05.008

2014-12-11

1. 浙江省科技厅公益性（动物平台）项目（2012C37079） 2. 浙江省医药卫生科技计划项目（2008B137）

陈方明（1981-）, 男, 实验师, 研究方向： 实验动物与比较医学。E-mail： 28483001@qq.com

陈民利（1963-）, 女, 教授, 研究方向为实验动物与比较医学。E-mail： cmli991@aliyun.com