不同前处理分析植物脂肪酸的气相色谱-质谱法研究

梁海东， 乔有明， 裴海昆， 段中华， 全小龙

(青海大学分析测试中心，青海西宁 810016)

酯类是植物和土壤有机质中非常重要的物质，而脂肪酸是植物体重要的组成成分之一，在大多数生物体中含量较高，是生物体酯类生物标记物中含量最丰富的。由于每一来源的脂肪酸均有显著的特征，所以近年来将脂肪酸作为生物标记物广泛应用于各种研究中[1,2]。

气相色谱是一种分析速度快、分离效能高、特异性及敏感性高，且能和多种检测手段联用的分离分析方法[3]，而气相色谱-质谱(GC-MS)法是迄今为止最有效的分析脂肪酸的方法[4]。由于长链脂肪酸沸点高、在高温下不易挥发、检测时柱温高、脂肪酸难分离，对脂肪酸定性和定量测定均有干扰，故采用GC或GC-MS分析脂肪酸的组成时，必需对样品进行前处理[5]，即将植物油中的脂肪酸甲酯化衍生转化为脂肪酸甲酯(FAME)[6]。用于GC-MS分析的前处理方法有多种，不同的处理方法可能会导致不同的测定结果，所以前处理对于结果的可靠性和准确性非常关键[7]，目前较为广泛的是硅烷化法和甲酯化法[8,9]。本文对硅烷化、HCl-甲醇甲酯化以及BF3-甲醇甲酯化三种脂肪酸提取方法进行比较，从可鉴定的脂肪酸种类、回收率、操作简易程度和经济成本等方面进行了分析，以期为植物脂肪酸的提取与分析提供方法上的参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DSQII GC-MS联用仪(美国，Thermo Fisher Scientific)，配NIST2008 版谱库；KQ-400KDB高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHA-C恒温振荡器(常州国华电器有限公司)。

肉豆蔻酸(C14∶0)、正十五烷酸(C15∶0)、棕榈酸(C16∶0)、十六碳烯酸(顺-9)(C16∶1)、珠光脂酸(C17∶0)、硬脂酸(C18∶0)、十八碳烯酸(顺-9)(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、十八碳三烯酸(顺-6，9，12)(C18∶3)、花生酸(C20∶0)、二十二烷酸(C22∶0)、二十二碳二烯酸(顺-13,16)(C22∶2)、二十二碳三烯酸(顺-13,16,19)(C22∶3)、二十四碳烯酸(顺-15)(C24∶1)标准品，配成混标液备用。内标液：正十五烷酸溶液、正十五烷酸甲酯溶液。KOH，正己烷、HCl、二氯甲烷、N,O -双三甲基硅基三氟乙酰胺、BF3-甲醇溶液(14%，m/V)均为分析纯，甲醇为色谱纯。

1.2 实验材料

植物样品采集自青海果洛的高寒草甸，混合样品，室温下自然风干，磨碎，过100目筛，放置在干燥避光处，用自封袋保存，备用。

1.3 样品处理

1.3.1硅烷化准确称取2.5 g样品于棕色带盖子的小瓶中，加入100 μL内标和10 mL二氯甲烷，密封，超声萃取50 min(每隔10 min摇匀一次)，静置5 min，取上层清液1.5 mL用0.45 μm滤膜过滤至2 mL样品瓶中，加200 μL N,O -双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)，常温下衍生60 min后，进行GC-MS分析。

1.3.2HCl-甲醇甲酯化准确称取0.2 g样品于棕色带盖的小瓶中，加入5 mL饱和KOH-甲醇溶液，摇匀后于75 ℃水浴中皂化10 min，提取液重复皂化一次，合并提取液，冷却后加入5 mL 5 mol/L HCl-甲醇溶液，在75 ℃的水浴中甲酯化10 min，冷却后，分2次加入5 mL正己烷进行萃取，将萃取后的正己烷溶液置于带刻度小试管中，氮吹至约1 mL，过0.45 μm滤膜后，进行GC-MS 分析。

1.3.3BF3-甲醇甲酯化称取50 mg样品，用二氯甲烷∶甲醇(2∶1，V/V)提取总的脂类物质。取2 mL总提取液，加入到棕色带盖子的小瓶中，在缓慢流动的氮气下吹干。干燥后，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，75 ℃水浴中皂化1 h，冷却后加入正己烷重复洗涤，除去中性物质，然后用2 mol/L HCl酸化至pH为3，最后用正己烷提取脂肪酸。氮气条件下吹至近干，通过蒸发除去正己烷，加入100 μL BF3-甲醇溶液(14%，m/V)，80 ℃的条件下甲酯化30 min后，加入2 mL超纯水终止反应，加入正己烷萃取。待溶剂蒸发后重新溶解在0.2 mL正己烷中，经0.45 μm滤膜后，用于GC-MS 分析。

1.4 GC-MS条件

色谱条件： DB-5MS色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气高纯氦(He)，流速1.0 mL/min；程序升温：柱温60 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升到180 ℃，4 ℃/min升到230 ℃，保持20 min，以20 ℃/min 升到280 ℃，持续2 min；进样量1 μL，不分流进样；进样口温度280 ℃。质谱条件：电离方式为电子轰击离子源模式(EI)，电离能量70 eV，离子源温度250 ℃，扫描方式为SCAN 模式，质量扫描范围m/z40～550，溶剂延迟7 min。

1.5 回收率的测定

加入混标液，分别用HCl-甲醇甲酯化和BF3-甲醇甲酯化方法进行3次平行试验，取3次的平均值。硅烷化方法因试剂、条件等可引起色谱柱流失，影响其寿命，因此未进行回收率和甲酯化率的测定。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS总离子流色谱图

由总离子流色谱图(TIC)可以看到多个色谱峰，使用NIST2008 版谱库进行分析检索，有效色谱峰数量为HCl-甲醇甲酯化>BF3-甲醇甲酯化>硅烷化。另外，根据离子强度值和内标物，可以初步确定三种前处理方法可检测到的脂肪酸浓度为BF3-甲醇甲酯化>HCl-甲醇甲酯化>硅烷化，甲酯化方法间相差不大，但大大高于硅烷化方法。

图1 硅烷化(A)、BF3-甲醇甲酯化(B)和HCl-甲醇甲酯化的GC-MS总离子流色谱图

2.2 可鉴定的脂肪酸种类

通过标准谱库以及与常见的14种标准品对照，GC-MS定性分析表明，三种方法可鉴定的脂肪酸种类有所不同。与标准品一致或检索后相似度大于80%的脂肪酸，HCl-甲醇甲酯化方法检测到的有32种，碳原子数为C4-C26，饱和脂肪酸20种，不饱和脂肪酸12种；直链脂肪酸29种，芳香酸3种。BF3-甲醇甲酯化方法可鉴定的脂肪酸为21种，碳原子数为C7-C26，饱和脂肪酸14种，不饱和脂肪酸7种；直链脂肪酸18种，芳香酸3种。硅烷化方法可鉴定的为13种，碳原子数为C3-C20，饱和脂肪酸8种，不饱和脂肪酸5种；直链脂肪酸11种，芳香酸2种。可见，HCl-甲醇甲酯化方法在鉴定脂肪酸种类上优势显著。

2.3 处理方法对仪器的影响

硅烷化方法对仪器具有较大的影响，尤其是对于色谱柱，影响尤其明显，使用1～2次后色谱柱即造成较严重的固定相流失，两种甲酯化方法对于色谱柱都没有发生明显损害现象，因此，从延长色谱柱的寿命和保护仪器的角度，甲酯化应予以优先考虑，硅烷化方法次之。

2.4 甲酯化方法回收率的比较

由表1可看出，HCl-甲醇甲酯化的回收率大多高于85%，其中7种脂肪酸高于90%，最低的棕榈酸回收率为54.28%；BF3-甲醇甲酯化的回收率大多高于50%，其中2种脂肪酸高于90%，最低的硬脂酸回收率为22.39%，并进一步算得前者正十五烷酸的甲酯化率为88.20%，后者为81.23%。因此从回收率和初步的甲酯化率来看，HCl-甲醇甲酯化方法的效果更好。

表1 脂肪酸回收率

2.5 甲酯化方法操作比较

HCl-甲醇甲酯化方法操作简单、便捷，单位样品的分析成本较低，1 d可以批量处理12～16个样品；BF3-甲醇甲酯化方法耗时长，对操作者的要求高，操作繁琐，1 d仅可以处理4～8个样品，且样品的分析成本较HCl-甲醇甲酯化高。因此，HCl-甲醇甲酯化方法的优势是十分明显的。

2.6 分析与讨论

实验中发现，应用HCl-甲醇甲酯化过程中，加入HCl-甲醇进行甲酯化后若溶液呈现碱性则甲酯化失败，因此必须确定HCl-甲醇加入后呈现酸性，若呈碱性，可适量加大HCl-甲醇的用量。此外，HCl-甲醇甲酯化方法的回收率可以通过更加精细合理的操作加以提高，甲酯化率则可以通过对皂化过程的时间温度以及甲酯化过程时间温度进行优化加以提高。

3 结论

通过比较硅烷化衍生、HCl-甲醇甲酯化衍生和BF3-甲醇甲酯化衍生三种分析植物样品中脂肪酸的方法，硅烷化可引起色谱柱固定相流失，影响其寿命，而HCl-甲醇甲酯化、BF3-甲醇甲酯化对色谱柱影响甚微。HCl-甲醇甲酯化比BF3-甲醇甲酯化和硅烷化识别的脂肪酸种类多，操作简单，耗时短，因此GC-MS是理想的植物脂肪酸提取分析方法。