提高芍药愈伤组织中芍药苷和芍药内酯苷的含有量

马莹莹，　胡 升，　江海龙，　冯定军，　俞 伟，　梅乐和，*

（1.浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江　杭州　310027；2.浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江　宁波　315100；3.宁波立华制药有限公司，浙江　宁波　315174）

提高芍药愈伤组织中芍药苷和芍药内酯苷的含有量

马莹莹1，胡 升2，江海龙3，冯定军3，俞 伟3，梅乐和1，2*

（1.浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州310027；2.浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院，浙江宁波315100；3.宁波立华制药有限公司，浙江宁波315174）

目的 进一步优化芍药愈伤组织中积累芍药双苷（芍药苷和芍药内酯苷）的培养条件。方法 以芍药愈伤组织中芍药双苷的量为响应值，采用P1ackett-Burman实验设计对8个影响愈伤组织生长和芍药双苷积累的植物激素（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ）的质量浓度、蔗糖的含有量、Ca2+量、NH4+∶NO3-的比例及光照中筛选出了3个关键因素，通过最陡爬坡逼近和响应面优化方法确定这些因素的最适水平。结果 三个因素的最佳条件为：40.20 g/L蔗糖、0.33 mg/L 6-BA和1.08 mg/L NAA。结论 在此最优培养条件下，芍药愈伤组织合成芍药双苷的能力比优化前提高了33%，芍药双苷占愈伤组织干重含有量达到37.60 mg/g。

愈伤组织；芍药苷；芍药内酯苷；P1ackett-Burman法；中心组合实验；优化；萘乙酸（NAA）；6-苄氨基嘌呤（6-BA）

中药材白芍是毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pa11.的干燥根，主产于浙江、四川、安徽等省。白芍气微，味微苦、酸，具有养血、柔肝、敛阴、收汗、缓急止痛等功效。白芍的主要药效成分是属于单萜苷类化合物［1］，以芍药苷和芍药内酯苷（二者合称为芍药双苷）为主要成分的芍药总苷。在《中国药典》2010年版中，已将芍药总苷作为白芍的质量控制指标［2］。现代药理研究表明，芍药总苷能通过多途径抑制自身免疫反应［3］，因而具有抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多种药理作用，目前在临床已用于对类风湿性关节炎的治疗，并取得了良好的治疗效果［4］。

芍药苷的传统制备方法是先种植芍药，待芍药生长2～4年后挖取芍药根，经晒干炮制得到赤芍或白芍，然后制药企业从白芍产地收购赤芍或白芍后再从中分离提取芍药苷。由于整个生产过程所需的周期较长，而且赤芍和白芍中芍药双苷的含有量较低（一般为干质量的1%左右），这使得从赤芍或白芍中提取芍药双苷存在成本高、效率低的问题，不仅限制了产量，而且产品的价格也居高不下。此外，芍药中芍药双苷的含有量还受到芍药生长产地、季节、气候以及栽培管理水平等多种因素的影响，导致它们的含有量有常常低于这一水平。更不利的是，日趋严重的土壤、水和空气污染还使得产品的安全性由于重金属及农药残留的存在而受到影响。这些不足也是传统天然药物提取和生产所面临的普遍性问题。

为了解决这些问题，开展了芍药愈伤组织的诱导和培养研究，以期通过诱导并规模化培养芍药愈伤组织，缩短芍药细胞中芍药双苷的积累时间，并通过对愈伤组织细胞培养条件的优化，促进细胞中芍药双苷的积累，提高细胞中芍药双苷的含有量。虽然目前已有一些关于芍药愈伤组织的研究，但这些研究主要是从芍药的育种目的出发，通过对芍药愈伤组织的诱导、增殖和分化培养，进行芍药的品种改良和高效繁殖［5-7］。除此之外，有关芍药的研究主要涉及对药材中芍药双苷的提取、检测［8-9］；芍药主要成分的分离测定［1，10］；以及芍药苷的药效和药物动力学研究［11］。迄今为止，还未见通过愈伤组织制备芍药双苷的研究。在前期研究中，已经利用芍药的根、茎、叶等不同外植体获得了相应的芍药愈伤组织，并从培养的愈伤组织中提取获得了芍药双苷，并发现愈伤组织中芍药双苷的含有量高于它们在芍药外植体中的含有量。本实验进一步对芍药愈伤组织生产芍药双苷的培养条件进行了考察和优化，通过对关键影响因素的优化来提高愈伤组织中芍药双苷含有量，为实现芍药双苷的愈伤组织规模化制备创造条件。

1　材料与方法

1.1仪器与材料 LC2000高效液相色谱仪（Hitachi L-2400单波长紫外检测器）（天美中国仪器科技公司），SinoChrom ODS-BP反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）（大连依利特）；AL204电子分析天平（Mett1er To1edo）。

芍药苷对照品（≥97%，批号1023930）、芍药内酯苷对照品（≥97%，批号1023928）由西亚试剂提供；甲醇、乙腈为色谱纯（批号分别为3C290281、4C180115；上海安普科学仪器有限公司）；磷酸二氢钾为分析纯，水为超纯水；样品材料（亳州芍药叶愈伤组织）为本实验室自行培养。

1.2愈伤组织培养 选取实验室种植的生长旺盛、无病虫害的亳州芍药植株叶片，反复冲洗干净后于超净工作台内用75%乙醇消毒30 s，然后用10% NaC1O浸泡10 min，再用无菌水冲洗3～5次，置无菌滤纸上晾干，切为1 cm2左右后接种在诱导培养基（WPM培养基［12］+2 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA）+0.2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D））中进行培养，25 d后将诱导出的生长较好的愈伤组织切割成小块后转接至固体继代培养基（WPM培养基+0.5 mg/L 6-BA+ 1 mg/L NAA+0.1 mg/L脱叶灵（TDZ））中进行培养，培养温度（24±1）℃，光照强度1 500 1x，以32 d为一次继代培养周期，在继代过程中选取相同继代批次的愈伤组织进行相同类型的优化实验，最终以相对于原始培养下生长的同一代愈伤组织作比较来确定最优条件。

1.3芍药愈伤组织中芍药双苷的提取及测定 在60℃恒温鼓风干燥箱将愈伤组织样品干燥至恒定质量，研磨为粉，用一定体积的甲醇浸渍约5 min，尔后60℃下超声处理30 min（功率为120W），萃取液在10 000 r/min离心10min后收集上清，离心上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，获得芍药双苷粗提物。样品中芍药双苷的种类通过与对照品保留时间对比鉴定，浓度通过标准曲线计算求取。通过HPLC参数测定样品溶液与对照品溶液中芍药双苷含有量，求出样品溶液中芍药双苷的量Mi。而芍药双苷在愈伤组织干燥品中的含有量Pi（mg/g）则按下式计算：

其中V为定容体积10 mL，Mi为芍药双苷质量浓度，Mw为称取的愈伤组织干品质量。

1.4实验设计

1.4.1P1ackett-Burman试验设计 P1ackett-Burman设计是1946年由P1ackett和Burman提出［13］的，用来筛选和评价影响响应值的主要因素。根据植物细胞生长所需营养要素的基本原则及查阅文献，最终选取可能影响芍药愈伤组织生长及芍药双苷产量的8个因素作为变量，愈伤组织中芍药双苷合成量为响应值。根据实验数据得到一个多元一次方程：

式中：Y—预测响应值；β0—模型截距；βi—一次系数；Ⅹi—自变量水平。

1.4.2最陡爬坡试验 最陡爬坡实验是根据P1ackett-Burman试验结果进行设计，用于找到逼近最大效应区域的点并将其用作进一步优化的中心点。最陡爬坡法以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、有效地逼近最大响应区域［14］。

1.4.3中心组合试验 中心组合试验是一种国际上较为常用的响应面法［15］。在最陡爬坡试验确定的区域内，根据试验数据得到以愈伤组织合成芍药双苷的含有量为响应值的多元二次回归方程。该方程为描述响应变量（因变量）与自变量（操作条件）关系的经验模型：

式中：Y—预测响应值；k—变量的数目；β0—模型常量；βi—一次系数；βii—二次系数；βij—相互作用系数。

利用“Design Expert.V 8.0.6.1”软件对试验数据进行统计分析和方差分析，估计模型在每种情况下的拟合度，并对影响因变量的各因子水平及其交互作用进行优化与评价，指明实验进行的方向，并对不同变量的优化组合所预测得到的最大响应值验证该模型的准确性［16］。

2　结果与讨论

2.1影响芍药愈伤组织合成芍药双苷能力的关键因素 基于P1ackett-Burman试验设计的原理，本研究确定的8个影响参数包括四种植物激素（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ）的质量浓度、蔗糖的含有量、Ca2+的量、NH4+：NO3-的比例及有无光照。为对这8个因素进行全面考察，选用了n=12的PB设计，并余留4个空项作误差分析。每个因素取2个水平：低水平“-”与高水平“+”。高水平取低水平的1.4～2.5倍。实验设计及结果如表1所示，各参数所代表因素、水平及效应见表2。P1ackett-Burman实验设计及数据分析采用Statistica软件（Version 6.0，Stat Soft，Inc.，USA）进行设计与分析。

表1　PIackett-Burman实验设计及结果（n=12）Tab.1 PIackett-Burman design and resu Its（n=12）

由表2可知，对愈伤组织产芍药双苷能力有显著影响（≥90%）的是植物激素6-BA、NAA的质量浓度及蔗糖的量，适当降低6-BA质量浓度，提高NAA质量浓度及蔗糖的量可增强愈伤组织产芍药双苷的能力。因此，选择6-BA、NAA、蔗糖的量这三个因素作为进一步优化的因素。

表2　因素、水平及效应Tab.2 Variab Ies，IereIs and effects

2.2最陡爬坡试验 由P1ackett-Burman试验结果表明，植物激素NAA质量浓度和蔗糖含有量具有正效应，6-BA质量浓度具有负效应，因此在最陡爬坡试验中，增大NAA质量浓度和蔗糖的量，降低6-BA质量浓度更有利于愈伤组织中次级产物的代谢。根据实验的实际需要，对以上3个重要影响因素的步长进行了相应设计，设计及结果如表3，而其他因素的取值则根据正效应的因素取较高值，负效应的因素取较低值，具体安排如下：2，4-D为0.2 mg/L，TDZ为0.25 mg/L，NH4+∶NO3-比值为1∶2，Ca2+的量为正常WPM基础培养基的两倍并进行无光照培养。

由表3可见最优培养条件在处理3与处理4之间，故以处理3条件为后续实验中心点进行中心组合实验。

表3　最陡爬坡试验设计及结果Tab.3 Design and resu Its of the steepest ascent experiment

2.3响应面的拟合及最优条件确定 影响芍药愈伤组织生长速率和愈伤组织的芍药双苷积累能力的因素较多，在前期研究中，采用单因素试验对培养基组成——包括培养基中4种植物激素（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ）的质量浓度、蔗糖的量、Ca2+的量、NH4+∶NO3-的比例，生长温度，光照条件对愈伤组织生长及愈伤组织中芍药双苷含有量的影响进行了考察，并在单因素实验中初步确定了这些因素的适宜水平。但是，由于这些因素间可能存在的交互效应，单因素实验难以确定愈伤组织培养的最佳条件。为了高效、准确的了解这些因素对愈伤组织生长和芍药双苷积累能力的影响规律，并确定最佳的愈伤组织培养条件，有必要采取适当的统计优化方法进行更全面和深入的培养条件优化研究。

响应面分析法（response surface methodo1ogy，RSM）是一种进行复杂条件优化的有效方法，它能对多个影响因素及它们的交互效应进行考察，通过描述影响因素与响应之间的数学模型，帮助研究者认识和分析相关因素影响特定响应的规律，并通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制，可方便地确定对应最大响应的最佳条件。同时，此方法考虑了试验随机误差，并将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的多项式模型来拟合，计算简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法，已在制药工程、生物工程、化学化工等领域得到了广泛应用［17-18］。为了对准确认识培养基中关键成分和光照条件等因素对芍药双苷积累水平的影响规律，并确定最佳的愈伤组织培养条件，我们在通过PB实验识别了关键因素后，也采用了响应面方法进行了芍药愈伤组织培养条件的优化研究。

由PB试验结果和最陡爬坡试验结果可知，处理3是响应变量Y值最逼近最大芍药双苷合成量区域。因此，以处理3条件为中心点施行中心组合试验，同时在原始培养基中接入同一代的愈伤组织作为对照。因为有3个自变量，为了使拟合响应方程具有旋转性和通用性，选择中心点实验数为6，星号臂长γ=1.682［14］。各自变量水平见表4，试验设计见表5。

表4　中心组合试验中变量及其水平Tab.4 LeveIsandcodesofthevariabIesforCCD

表5　中心组合试验设计及结果Tab.5 DesignandresuItsofCCD

利用“DesignExpert.V8.0.6.1”软件对表5中的实验数据进行二次多项式回归拟合，得到芍药双苷总量对植物激素6-BA、NAA质量浓度及蔗糖质量浓度的二次模型为：

Y=39.52+4.40A-3.38B-1.17C+2.99AB+ 2.34AC-2.62BC-3.31A2-2.33B2-2.52C2

式中，Y为芍药愈伤组织中芍药双苷含有量的预测值；A、B、C分别为植物激素6-BA、NAA质量浓度及蔗糖的量的编码值。该模型的方差分析见表6。结果表明，该模型的可信度水平均大于99.99%（P＜0.0001），说明该模型极显著，在被研究的整个回归区域拟合较好；复相关系数为r2= 0.9642，说明预测值和实际值之间相关性较好；Adjr2=0.9320，说明应变量中芍药双苷含有量仅有约6.8%的变异不能由该模型表示；变异系数为Rsp=5.4%，说明实验的可信度和精确度较高；精密度（AdeqPrecision）是有效信号和噪声的比值，大于4.0视为合理，实验的精密度达到了19.740。因此我们认为该经验模型可用来预测响应值。

表6　芍药双苷含有量响应面二次模型的变量分析Tab.6 AnaIysisofvariances（ANOVA）forresponsesurfacequadraticmodeIoftotaIgIucosidescontent

图1　6-BA、NAA及蔗糖对芍药愈伤组织中芍药双苷的影响Fig.1　ResponsesurfacepIotofeffectsontotaIgIucosidesproductionbysucrose，6-BAandNAA

每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用，此时第三个变量保持在编码0的水平，由响应面图1可直观地看出各因子对响应面的影响变化趋势，求解方程（1）可得模型极值点坐标：A= 0.33 mg/L，B=1.08 mg/L，C=40.20 g/L，此时模型预测的芍药双苷含有量最大值为36.81 mg/g，是原始培养基的1.31倍（同时接入的同批次的愈伤组织在原始WPM培养基中，测得芍药双苷含有量为28.03 mg/g）。为了检验模型预测的准确性，在最佳培养基条件和原始培养基条件分别进行了另一批次的愈伤组织培养实验，最优条件下愈伤组织芍药双苷总量达到37.60 mg/g，而原始条件下愈伤组织芍药双苷总量28.27 mg/g。这一结果不仅表明所建立的模型具有较为准确的预测能力，而且也证明通过响应面优化，使芍药愈伤组织的芍药双苷含量提高了33%，较好地实现了研究目的。

由优化结果可知，A-6-BA和B-NAA这两种激素对愈伤组织中芍药双苷的含有量具有最显著的影响，它们在培养基中的最佳的质量浓度分别为0.33 mg/L和1.08 mg/L；而在优化前，这两种激素的质量浓度分别为0.20mg/L和2.00mg/L。这两个激素的使用质量浓度都有显著的变化，分别提高了65%和减少了46%。由于激素不仅直接影响细胞的生长，而且还调控代谢产物的合成，因此这两种激素使用浓度的改变是促进愈伤组织中芍药双苷积累的关键原因。细胞分裂素6-BA具有促进细胞分裂，促进生物体内物质积累，防止老化等作用［19］，而生长素NAA主要作用于促进生长及增产［20］，其两者之间的比例不同，对植物生长及活性物质的积累影响也不同［21］。在另一方面，由于植物细胞和组织在培养中缺乏自养能力，需要外源碳源提供能量，因此增加培养基中蔗糖的含有量［22］可以促进愈伤组织的生长和芍药双苷在愈伤组织的积累。

3　结语

影响芍药愈伤组织的生长及代谢产物的积累的因素较多，包括培养基的各组分质量浓度及光照都对愈伤组织中芍药双苷的含有量产生影响。为了有效提高愈伤组织中芍药双苷的含有量，本实验首先通过P1ackett-Burman实验筛选出了决定芍药愈伤组织中芍药双苷合成的主要因素，然后通过最陡爬坡实验和响应面设计对这些因素的具体水平进行了优化，确定了有利于愈伤组织积累芍药双苷的最适培养条件：WPM基础培养基+0.2 mg/L 2，4-D+ 0.33 mg/L 6-BA+1.08 mg/L NAA+0.25 mg/L TDZ+40.20 g/L蔗糖，同时调节培养基中NH4+∶NO3-比值为1∶2，Ca2+的量为正常WPM基础培养基的两倍并进行无光照培养。通过优化，使芍药愈伤组织中芍药双苷的质量浓度较原始培养条件的浓度提高了33%，取得了较好的优化效果，为利用芍药愈伤组织进行芍药双苷的规模化制备创造了有利条件。

［1］高 小，田庚元.白芍化学成分研究进展［J］.中国新药杂志，2006，15（6）：416-418.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010.

［3］王预巍，王永钧.白芍总苷在自身免疫性疾病中的药理研究与临床应用［J］.浙江中医药大学学报，2007，31（2）：240-244.

［4］闵伟琪，魏 琴，李洪毓，等.白芍总苷治疗类风湿性关节炎的多中心临床研究［J］.中国药理学通报，1994，10（2）：117-122.

［5］Takashi H，Michiko A，Takehito K.In vitro propagation of herbaceous peony（Paeonia lactiflora Pa11.）by a 1ongitudina1 shoot-sp1itmethod［J］.Plant Cell Rep，1989，8（4）：243-246.

［6］Tian D K，Ken M T，Fenny D.Comparison of shoot induction abi1ity of different exp1ants in herbaceous peony（Paeonia lactiflora Pa11.）［J］.Sci Hortic，2010，123（3）：385-389.

［7］王吉凤，李 青，孟 会，等.5个芍药品种愈伤组织诱导及分化研究［J］.北京林业大学学报，2010，32（3）：213-216.

［8］Namsoo K，Kyung-rim P，In-Seon P.App1ication of nove1 HPLCmethod to the ana1ysis of regiona1 and seasona1 variation of the active compounds in Paeonia lactiflora［J］.Food Chem，2006，96（3）：496-502.

［9］Gao S，Tian JS，Cui Y L.A simp1e and rapidmethod for simu1taneous determination of a1bif1orin and paeonif1orin in White Peony Root［C］//In Internationa1Conference of Nationa1Product and Traditiona1 Medicine，NW Univ，Xi'an，China. 2009：250-253.

［10］Akira I.Triterpenoids from ca11us tissue cu1tures of Paeonia Species［J］.Phytochemistry，1995，38（5）：1203-1207.

［11］Sun W Y，WeiW，Wu L，etal.Effects andmechanisms of extract from Paeonia lactiflora and Astragalus membranaceus on 1iver fibrosis induced by carbon tetrach1oride in rats［J］.JEthnopharmacol，2007，112（3）：514-523.

［12］L1oyd G B，Mc Cown BH.Commercia11y feasib1emicropropagation of mountain 1aure1，Kalmia latifolia，by use of shoot-tip cu1ture［J］.Comb Proc Intl Plant Prop Soc，1980，30：421-427.

［13］P1ackett R L，Burman JP.The design of optimum mu1tifactoria1experiments［J］.Biometrika，1946，33（4）：305-325.

［14］Montgomery DC.Design and ana1ysisof experiments（third ed-iton）［M］.New York：John Wi1ey&Sons，1991.

［15］Wang ZW，Liu X L.Medium optimization for antifunga1active substances production from a new1y iso1ated Paenibacillus sp. using response surface methodo1ogy［J］.Bioresour Technol，2008，99（17）：8245-8251.

［16］Deepmoni D，BhargaviP，Ashish S，etal.Enhancementof ce1-1u1ase activity from a new strain of Bacillus subtilis by medium optimization and ana1ysis with various ce11u1osic substrates［J］. Enzyme Research，2011，2011（1）：1-8.

［17］朱冰雅，承 伟.响应面法优化及制备芦荟壳聚糖纳米粒［J］.中成药，2013，35（9）：1892-1896.

［18］张 彦，杨 宽，张梦欣，等.响应曲面法优化醋蒸南五味子工艺的研究［J］.中成药，2013，35（9）：1976-1980.

［19］Yan M M，Xu C，Kim CH，etal.Effects of exp1ant type，cu1-turemedia and growth regu1ators on ca11us induction and p1ant regeneration of Chinese jiaotou（Allium Chinense）［J］.Sci Hortic，2009，123（1）：124-128.

［20］王梦亮，任振兴，黄登宇，等.黄芩愈伤组织培养及黄芩苷合成调控的研究［J］.中草药，2006，37（6）：924-928.

［21］孙 珺，胡正海.红豆杉愈伤组织的诱导培养及紫杉醇的产生［J］.西北大学学报，2000，30（1）：55-59.

［22］邢思雷，计巧灵，刘小锐.培养条件对大叶白麻愈伤组织中三萜类化合物积累的影响［J］.中成药，2011，33（1）：103-107.

Content increase of paeonifIorin and aIbifIorin in caIIus cu Iture of Paeonia lactiflora PaII.

MA Ying-ying1，HU Sheng2，JIANG Hai-1ong3， FENG Ding-jun3， YUWei3， MEILe-he1，2*
（1.Department of Chemical and Biochemical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China；2.College of Biological and Chemical Engineering，Ningbo Institute of Technology of Zhejiang University，Ningbo 315100，China；3.Ningbo Liwah Pharmaceutical Co.，Ltd.，Ningbo 315174，China）

AIM To optimize key factors in ca11us cu1ture of Paeonia lactiflora Pa11.for accumu1ation increase of paeonif1orin and a1bif1orin.METHODS With the tota1amountof paeonif1orin and a1bif1orin as the response indicator，three out of eight parameters for the measurement of ca11us cu1ture of Paeonia lactiflora Pa11.，phytohormone（NAA、2，4-D、6-BA、TDZ），sucrose，Ca2+，ratio of NH4+and NO3-，and 1ight treatmentwere checked by P1ackett-Burman experimenta1design.The steepest ascentmethod in combination with centra1composite designand response surfacemethod were app1ied to determining the optima1 1eve1s of these factors.RESULTS 40.20 g/L sucrose，0.33 mg/L 6-BA，and 1.08 mg/L NAA were identified as themost satisfactory conditions.CONCLUSION The abovementioned conditions breed a tota1content increase（of near1y 33%）of paeonif1orin and a1bif1orin，37.60 mg/g，ca1cu1ated at dry weight.

ca11us，paeonif1orin and a1bif1orin，P1ackett-Burman design，response surfacemethod，optimization 6-benzy1aminopurine（6-BA）；naphthy1acetic acid（NAA）

R282.2

A

1001-1528（2015）01-0078-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.016

2013-12-15

国家自然科学基金项目（21176220，31240054）；宁波市重大科技项目（2011C11023）；浙江省自然科学基金重点项目（Z13B060008）

马莹莹（1989—），女，硕士生，研究方向：中药质量控制及分析。Te1：18868819116，E-mai1：xiazhipaomo@163.com

梅乐和（1964—），男，教授，博士生导师，研究方向：蛋白质分子设计和定向进化、生物制药。Te1：（0571）87953161，E-mai1：mei1h@zju.edu.cn

日期：2014-05-14

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20140514.0939.001.htm1