HPLC法同时测定尿毒灵灌肠液中的地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇

吴建华，　李玉山

（1.湖北民族学院附属民大医院，湖北　恩施　445000；2.湖北民族学院，湖北　恩施　445000）

HPLC法同时测定尿毒灵灌肠液中的地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇

吴建华1，李玉山2*

（1.湖北民族学院附属民大医院，湖北恩施445000；2.湖北民族学院，湖北恩施445000）

目的 建立同时测定尿毒灵灌肠液中地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇方法。方法HPLC法采用依利特Hypersi1C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流动相A为甲醇-乙腈（1∶1），流动相B为0.5%磷酸溶液；体积流量1.2 mL/min；地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ的检测波长为203 nm，花旗松素和落新妇苷的检测波长为289 nm，白藜芦醇的检测波长为306 nm。结果 地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇分别在0.072 8～1.456 0μg（r=0.999 7）、0.037 4～0.748 0μg（r=0.999 8）、0.012 6～0.252 0μg（r= 0.999 3）、0.086 2～1.724 0μg（r=0.999 9）、0.035 6～0.712 0μg（r=0.999 5）范围内呈良好的线性关系；地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇的平均加样回收率分别为98.6%、97.6%、96.9%、99.1%、98.4%，RSD（n=6）分别为0.8%、0.7%、0.7%、0.6%、0.5%。结论 本法所测5个组分均能达到基线分离，各组分峰型良好，分离度均大于2。

尿毒灵灌肠液；地榆皂苷-Ⅰ；地榆皂苷-Ⅱ；花旗松素；落新妇苷；白藜芦醇

尿毒灵灌肠液处方源自国家药品标准中药成方制剂第二十册，由甲组和乙组两部分组成。甲组为灰绿色的粉末，味淡。由地榆、土茯苓、大黄、连翘、龙骨（煅）、蒺藜、牡蛎（煅）、丹参、桂枝、槐米、钩藤、青黛、栀子、黄柏、金银花等15味药物组成，是方中的主组分。乙组为棕褐色的液体，味淡。由生晒参、麦冬、枸杞、白茅根、红花5味药物组成，是方中的辅助成分。尿毒灵灌肠液具有通腑泄浊、利尿消肿的功效，可用于全身浮肿，恶心呕吐，大便不通，无尿少尿，头痛烦躁，舌黄，苔腻，脉实有力，以及各种原因引起的肾功能衰竭、氮质血症及肾性高血压等症的治疗。原部颁标准中仅对方中部分药材进行了定性鉴别，未对方中的任何药物进行成分定量测定［1-2］，不能有效地控制产品的质量和疗效，同时地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ为地榆的主要成分，花旗松素、落新妇苷、白藜芦醇为土茯苓的主要成分和有效成分［3］，本实验采用高效液相梯度洗脱法对尿毒灵灌肠液中地榆中的地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ和土茯苓中的花旗松素、落新妇苷、白藜芦醇进行定量测定方法研究，为完善该制剂质量标准提供依据。

1　试药与仪器

1.1仪器 Agi1ent 1200高效液相色谱仪，G1311A四元泵、G1330B自动进样器恒温器、G1322A脱气机、Chemstation色谱工作站、G1315B可变波长检测器，XP205型梅特勒电子天平（精度：0.01 mg）。

1.2试药 地榆皂苷-Ⅰ对照品（批号111952-201301，纯度95.1%）、花旗松素对照品（批号111816-201102，纯度98.9%）、落新妇苷（批号111798-201303，纯度92.4%）、白藜芦醇（批号111535-200502，纯度100.0%）均购于中国食品药品检定研究院；地榆皂苷-Ⅱ对照品（批号35286-59-0，纯度98.0%）购于上海田源生物技术有限公司；尿毒灵灌肠液（市售；甲组每瓶装20 g，乙组每瓶装200 mL；批号分别为20140101、20140102、20140103）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；磷酸（分析纯，广州化学试剂二厂）。

2　方法与结果

2.1色谱条件 依利特Hypersi1 C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；体积流量1.2 mL/min；流动相A为甲醇-乙腈（1∶1），流动相B为0.5%磷酸溶液［4-7］，梯度洗脱（0～10 min，45.0%A；10～27 min，45.0%→60.0%A；27～40 min，60.0%A；40～45 min，60.0%→45.0% A）；检测波长（0～27 min，λ1=203 nm［8-9］；27～35 min，λ2=289 nm［10］；35～45 min，λ3= 306 nm［11］）；进样量10μL。此系统条件下所测组分与其他组分分离效果良好，理论塔板数按花旗松素计不得低于3 000，分离度均大于2。

2.2样品制备

2.2.1混合对照品溶液配制 精密称取5种对照品地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇各适量，分别置于5个20 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀释至刻度，再分别精密吸取上述溶液10、5、2、10、5 mL置于50 mL量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（地榆皂苷-Ⅰ为0.072 8 mg/mL，地榆皂苷-Ⅱ为0.037 4 mg/mL，花旗松素为0.012 6 mg/mL，落新妇苷为0.086 2 mg/mL，白藜芦醇为0.035 6 mg/mL）。

2.2.2供试品溶液的制备 取本品甲组成分适量，研细，混匀，称取约1.0 g，精密称定，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声波（功率160 W，频率50 kHz）超声处理30 min，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照试验 按尿毒灵灌肠液处方比例称取除地榆的其余药味和除土茯苓的其余药味各一份，按尿毒灵灌肠液的制备工艺分别制成地榆空白样品和土茯苓空白样品，按照上述供试品溶液的配制方法制成地榆空白溶液和土茯苓空白溶液。分别精密吸取10 μL的供试品溶液、混合对照品溶液、地榆空白溶液及土茯苓空白溶液，按上述方法测定，结果显示各待测组分分离效果良好，阴性样品无干扰。见图1。

图1　地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇的HPLC图谱Fig.1　HPLC of ziyu-gIycosideⅠ，ziyu-gIycosideⅡ，taxifoIin，astiIbin and resveratroI

2.3方法学考察

2.3.1线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0μL，依次注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行分析测定，以峰面积Y与进样量Ⅹ进行线性回归，得地榆皂苷-Ⅰ回归方程为：Y=3.151 6×106Ⅹ-415.7，r=0.999 7，线性范围为0.072 8～1.456 0μg；地榆皂苷-ⅡY=2.304 2×106Ⅹ+197.5，r=0.999 8，线性范围为0.037 4～0.748 0μg；花旗松素Y=1.298 1×106Ⅹ-263.6，r=0.999 3，线性范围为0.012 6～0.252 0 μg；落新妇苷Y=3.361 9×106Ⅹ+513.8，r= 0.999 9，线性范围为0.086 2～1.724 0μg；白藜芦醇Y=2.611 9×106Ⅹ+394.1，r=0.999 5，线性范围为0.035 6～0.712 0μg。结果表明：各成分在对应的线性范围内，进样量与峰面积线性关系良好。

2.3.2精密度试验 取“2.2.1”项下的混合对照品溶液按照“2.1”项下色谱条件，精密吸取混合对照品溶液10μL，连续重复进样6次，分别测得5种成分的峰面积，计算各成分相对标准偏差，RSD分别为0.5%（地榆皂苷-Ⅰ）、0.9%（地榆皂苷-Ⅱ）、0.9%（花旗松素）、0.4%（落新妇苷）和0.8%（白藜芦醇）。结果表明，仪器精密度良好。

2.3.3重复性试验 称取同一批号供试品（批号131201），按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件依法进样测定，计算各成分含有量和相对标准偏差，RSD分别为0.5%（地榆皂苷-Ⅰ）、0.8%（地榆皂苷-Ⅱ）、0.9%（花旗松素）、0.3%（落新妇苷）和0.7%（白藜芦醇）。结果表明，本法测定重复性良好。

2.3.4稳定性试验 精密吸取同一批样品（批号131201）的同一供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后，每次进样10μL，测定其峰面积值，求得各组分RSD分别为0.5%（地榆皂苷-Ⅰ）、0.8%（地榆皂苷-Ⅱ）、0.9%（花旗松素）、0.4%（落新妇苷）和0.6%（白藜芦醇）。表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.5加样回收率试验 取已知含有量的同一批（批号131201）尿毒灵灌肠液甲组成分（地榆皂苷-Ⅰ为3.67 mg/g、地榆皂苷-Ⅱ为1.85 mg/g，花旗松素为0.634mg/g，落新妇苷为4.32mg/g，白藜芦醇为1.76 mg/g）适量，研细，混匀，取约0.5 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液25 mL和60%甲醇25 mL，按“2.2.2”项下供试品溶液的配制方法制备加样供试品试液。按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算各组分回收率，结果见表1。

2.4样品测定 取3个批号的样品甲组成分，按“2.2.2”项下供试品制备方法，按“2.1”项下色谱条件测定本品中地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇，结果见表2。

表1　地榆皂苷-Ⅰ、地榆皂苷-Ⅱ、花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇回收率试验Tab.1 ResuItsofrecoverytestsforziyu-gIycosideⅠ，ziyu-gIycosideⅡ，taxifoIin，astiIbinandresveratroI

表2　样品测定结果（±s，n=3）Tab.2 ResuItsofcontentdetermination（±s，n=3）

表2　样品测定结果（±s，n=3）Tab.2 ResuItsofcontentdetermination（±s，n=3）

批 号地榆皂苷-Ⅰ/（mg·g-1）地榆皂苷-Ⅱ/（mg·g-1）花旗松素/（mg·g-1）落新妇苷/（mg·g-1）白藜芦醇/（mg·g-1）1312013.67±0.041.85±0.020.634±0.0044.32±0.021.76±0.02 1312023.42±0.021.78±0.020.641±0.0064.57±0.041.82±0.02 1312033.89±0.031.96±0.010.629±0.0034.19±0.021.68±0.01

3　讨论

3.1供试品溶液提取方法的选择 在选择供试品溶液提取方法时，考察比较了超声提取和回流提取两种方法对提取效果的影响，按照本实验中的色谱条件测定，结果加热回流2h与超声提取30min结果相当，考虑操作简便性，选用超声提取30min作为供试品溶液制备的提取方法。

3.2流动相的选择 在流动相的选择中，还曾考察了不同比例的甲醇-0.5%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水为流动相梯度洗脱，结果以甲醇-0.5%磷酸溶液梯度洗脱时，各组分分离度差，地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ出现峰型重叠；以乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-水为流动相梯度洗脱，地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷-Ⅱ峰形对称，但花旗松素、落新妇苷和白藜芦醇峰型不对称，拖尾现象严重。而以甲醇-乙腈（1∶1）与0.5%磷酸溶液为流动相梯度洗脱时，所测5个组分均能达到基线分离，各组分峰型良好，分离度均大于2。

［1］国家药典委员会.国家药品标准中药成方制剂：第二十册［S］.北京：人民卫生出版社，1998：128.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：17-18，117-118，附录30，附录36.

［3］翟延君，佟苗苗，程 飞，等.花旗松素和3，3′-二甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对肿瘤细胞的增殖抑制作用［J］.中成药，2012，34（2）：217-220.

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Determ ination of ziyu-gIycosideⅠ，ziyu-gIycosideⅡ，taxifoIin，astiIbin and resveratroI in Niaodu Iing Enema by HPLC

WU Jian-hua1， LIYu-shan2*
（1.University Hospital of Hubei University for Nationalities，Enshi445000，China；2.Hubei University For Nationalities，Enshi445000，China）

AIM To deve1op amethod for determination of the contents of ziyu-g1ycosideⅠ，ziyu-g1ycosideⅡ，taxifo1in，asti1bin and resveratro1in Niaodu1ing Enema.METHODS The HPLCmethod was app1ied and the chromatographic co1umn was an Hypersi1 C18co1umn（4.6 mm×200 mm，5μm）.The f1ow rate was 1.2 mL/min.Themobi1e phase A consisted ofmethano1-acetonitri1e（1∶1），themobi1e phase B consisted of 0.5% phosphoric acid so1ution；λ1=203 nm（ziyu-g1ycosideⅠand ziyu-g1ycosideⅡ），λ2=289 nm（taxifo1in and asti1bin），λ3=306 nm（resveratro1）.RESULTS There was a good 1inear re1ationship between the concentration of ziyu-g1ycosideⅠ，ziyu-g1ycosideⅡ，taxifo1in，asti1bin，resveratro1and peak area va1uewhen the concentrations of ziyu-g1ycosideⅠ，ziyu-g1ycosideⅡ，taxifo1in，asti1bin and resveratro1 were within the ranges of 0.072 8-1.456 0μg（r=0.999 7），0.037 4-0.748 0μg（r=0.999 8），0.012 6-0.252 0μg（r=0.999 3），0.086 2-1.724 0μg（r=0.999 9），0.035 6-0.712 0μg（r=0.999 5），respective1y.The average recoveries were 98.6%（RSD=0.8%），97.6%（RSD=0.7%），96.9%（RSD=0.7%），99.1%（RSD=0.6%）and 98.4%（RSD=0.5%），respective1y.CONCLUSION Themethod can make fivemeasured constituents the base1ine reso1ution with good peak shape，and their reso1utions aremore than two.

Niaodu1ing Enema；ziyu-g1ycosideⅠ；ziyu-g1ycosideⅡ；taxifo1in；asti1bin；resveratro1

R927.2

A

1001-1528（2015）01-0112-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.022

2014-04-12

吴建华（1975—），男，硕士，主治医师，主要从事泌尿系统的临床基础研究。E-mai1：wujianhua1unwen@163.com

李玉山（1969—），男，副教授，主要从事基础医学研究工作，Te1：（0718）8437479，E-mai1：1iyushan1unwen@163.com