马齿苋抗糖尿病活性成分的研究

金 妍，　徐华影，　陈 琛

（天津医科大学第二医院，天津　300211）

［成分分析］

马齿苋抗糖尿病活性成分的研究

金 妍，徐华影，陈 琛

（天津医科大学第二医院，天津300211）

目的 研究马齿苋抗糖尿病的活性成分。方法 马齿苋全草用75%乙醇提取，利用硅胶、凝胶等柱色谱及制备液相色谱进行分离，并根据有机波谱技术鉴定了化合物结构，进一步通过测定各个化合物对胰岛素抵抗的HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响以及黄酮苷类化合物对Akt磷酸化水平的影响来评价其抗糖尿病活性。结果 从马齿苋中分离鉴定了9个化合物，分别为芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷（1），橙皮苷（2），山柰酚（3），木栓酮（4），6，7-二羟基香豆素（5），反式-对香豆酸（6），金莲花碱（7），咖啡酸（8），二十八烷酸（9），此外化合物1～4能够显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗，其中化合物1的效果最为显著并能降低该细胞Akt的磷酸化水平。结论 化合物1为首次从该植物中分离得到并且具有较强的抗糖尿病活性。

马齿苋；黄酮苷；芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷；抗糖尿病活性

马齿苋Protulaca oleracea L.又名马齿草、长寿菜等，为马齿苋科一年生肉质草本植物，广泛分布于全世界温带和热带地区，是我国卫生部划定的78种药食同源的野生植物之一。性味酸寒，具有清热解毒，凉血止血之功。现代药理学研究表明马齿苋具有降血脂、降血糖和抗动脉粥样硬化等功能［1-2］。文献报道其化学成分主要有生物碱、萜类、有机酸、黄酮、挥发油、香豆素和多糖等［2］。本实验运用大孔吸附树脂、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱的方法从马齿苋乙醇浸膏中分离鉴定了9个化合物，包括黄酮苷类化合物，香豆素类化合物，有机酸类化合物及三萜类化合物，其中化合物1为首次从该植物中分离得到，此外，本实验对分离得到的黄酮苷类化合物进行了抗糖尿病活性的筛选，结果显示化合物1具有较强的抗糖尿病活性。

1　仪器与材料

Bruker AV 400核磁共振仪（TMS内标）；JASCO半制备高效液相色谱仪（PU-2089，RI-2031，UV-2075，JASCO日本分光株式会社）；UV-3310型紫外-可见分光光度计（日本日立集团）；YMCPack ODS-A SH-343-5色谱柱（20 mm×250 mm，5μm）；A sahipak GS-20G H200142，H200143色谱柱（20 mm×500 mm，5μm）；柱色谱和薄层色谱用硅胶（青岛海洋化工厂）；37℃，5%CO2细胞培养箱（力康生物医疗技术控股有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；全自动酶标板分析仪（美国伯乐公司）；倒置显微镜（奥林巴斯有限公司）；所用试剂均为分析纯；氘代试剂（西格玛奥德里奇上海贸易有限公司）；含酚红或不含酚红DMEM培养液（北京四环科技公司）；胎牛血清（FBS），PBS（HyC1one）；葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物药业有限公司）；25%（含EDTA）胰蛋白酶（以色列生物工业公司）；胰岛素（法国Li1y公司）HepG2细胞购自中科院上海细胞库，Akt、p-Akt及Actin抗体（美国CST公司）。

马齿苋Protulaca oleracea L.采自四川（2012年4月），由兰州大学生命科学院及甘肃省食品药品检验所共同鉴定为Protulaca oleracea L.，标本（D20120423）存放于天津医科大学第二医院药剂科中药房。

2　实验方法

2.1提取分离 取自然干燥的马齿苋全草10.0 kg，粉碎后用75%的乙醇加热回流提取3次，每次6 h，提取液减压浓缩，得浸膏900 g，将浸膏以水混悬，依次用水饱和的石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚提取物242 g，乙酸乙酯提取物125 g，正丁醇提取物138 g。3 kg马齿苋石油醚提取物及1.5 kg乙酸乙酯提取物分别以硅胶柱层析（100～200目）分离，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇系统梯度洗脱，洗脱梯度为石油醚-乙酸乙酯（8∶1，6∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3），100%乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇（95∶5，90∶10，80∶20）和100%甲醇依次梯度洗脱，通过TLC合并类似组分，石油醚提取物分离得到26个组分（PA～PZ），乙酸乙酯提取物分离得到15个组分（EA～EO）。

组分PG经过凝胶渗透柱层析Toyopea1HW-40分离，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脱，得到Fr. PG1～Fr.PG4，Fr.PG2（879.0 mg）再经制备高效液相色谱分离纯化，分别得到化合物3（26.5 mg），化合物5（21.6 mg）；组分PK经过凝胶渗透柱层析Toyopea1 HW-40分离，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脱，得到Fr.PK1～Fr.PK5，Fr.PK3（934.7 mg）再经制备高效液相色谱及制备薄层色谱法分离纯化，分别得到化合物2（24.5 mg）和化合物6（11.0 mg）。组分EF经过凝胶渗透柱层析Toyopea1HW-40分离，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，得到Fr.EF1～Fr.EF4，Fr.EF2（1 256.3 mg）再反复经制备高效液相色谱法分离纯化，分别得到化合物1（22.1 mg），化合物7（16.9 mg）。组分EH经过凝胶渗透柱层析Toyopea1HW-40分离，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，得到Fr.EH1～Fr.EH4，Fr.3（842.9 mg）再反复经制备高效液相色谱法及重结晶法分离纯化，分别得到化合物4（34.2 mg），化合物9（15.1 mg）。组分EM经过凝胶渗透柱层析Toyopea1HW-40分离，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，得到Fr.EM1～Fr.EM6，Fr.PK4（921.4 mg）再经制备高效液相色谱及制备薄层色谱法分离纯化，得到化合物8（20.5 mg）。

2.2胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗实验 将处于对数生长期的细胞消化后，用含10%FBS的DMEM培养基调整细胞密度为105个/mL，转入96孔板中。待细胞单层贴壁后，加入新配制的含有10-7mo1/L胰岛素的培养液，并设无胰岛素的空白孔，于37℃5%CO2培养箱中孵育36 h后弃去培养液，先用pH4.0的无酚红的DMEM洗4次，再用无酚红DMEM洗2次后，换上无血清的培养基37℃孵育24 h后，用葡萄糖临床试剂盒检测培养基的葡萄糖含有量。实验分别设正常细胞组、胰岛素抵抗模型组、化合物处理组（终浓度分别为1、5、10μmo1/L）。以不铺细胞的空白孔为空白对照，计算24 h各组细胞的葡萄糖消耗量。根据初筛3个浓度下的葡萄糖消耗量重新设定5个浓度进行EC50值的测定，测定的数据经SPSS 11.0统计软件系统进行统计学分析，以±s表示，组间差异的显著性采用t检验方法进行，EC50的计算采用非线性拟合方法进行。

2.3磷酸化Akt及非磷酸化Akt蛋白水平的检测

本实验采用免疫印迹法（Western B1ot法），方法简述如下：细胞加裂解液裂解后取上清，加入5X蛋白上样缓冲液95℃沸煮5 min后在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳后转移至PVDF膜上，然后用5%的脱脂牛奶封闭1 h，洗膜后将膜分割，分别加入Akt、p-Akt和β-actin的抗体，稀释比例为1∶1 000稀释，4℃过夜。再次洗膜后加入第二抗体进行反映，室温孵育1 h，洗膜后ECL荧光显色和曝光。利用图像分析系统确定X线光胶片上蛋白条带的相对灰度。

3　结果

3.1结构鉴定

化合物1：黄色粉末，mp 247～249℃。1HNMR（CDC13，400 MHz）δ：6.88（1H，s，H-3），6.21（1H，s，H-6），6.51（1H，s，H-8），8.04（2H，d，J=8.3 Hz，H-2′，6′），7.21（2H，d，J= 8.3 Hz，H-3′，5′），12.90（1H，br s，OH-5），5.54（1H，br s，H-1″），1.10（3H，d，J=6.1 Hz，H-6″）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ：164.1（C-2），104.8（C-3），182.8（C-4），162.4（C-5），98.6（C-6），165.3（C-7），95.0（C-8），158.4（C-9），104.9（C-10），124.9（C-1′），129.3（C-2′，6′），117.7（C-3′，5′），160.0（C-4′），99.9（C-1″），71.0（C-2″），71.3（C-3″），72.7（C-4″），70.8（C-5″），18.9（C-6″）。以上光谱数据与文献［3］报道基本一致，因此鉴定化合物1为芹菜素-4′-O-α-L-鼠李糖苷。

化合物2：白色粉末，mp 286～287℃。1HNMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：1.09（3H，d，J= 6.5 Hz，H-6‴），5.52（1H，dd，J=3，12.5 Hz，H-2），2.77（1H，dd，J=3.0，17.0 Hz，H-3），3.27（1H，dd，J=12.0，17.0 Hz，H-3），3.79（3H，s，OCH3-4′），3～3.58（10H，糖上质子），4.54（1H，s，H-1‴），4.95（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），6.15（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.18（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.93（3H，m，H-2′，5′，6′）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：78.5（C-2），42.2（C-3），197.2（C-4），163.3（C-5），96.6（C-6），165.5（C-7），95.8（C-8），162.8（C-9），100.7（C-10），130.9（C-1′），114.3（C-2′），148.1（C-3′），146.7（C-4′），112.3（C-5′），117.9（C-6′），55.8（C-7′），99.8（C-1″），73.1（C-2″），76.5（C-3″），70.5（C-4″），75.7（C-5″），66.2（C-6″），103.9（C-1‴），70.9（C-2‴），72.2（C-3‴），69.8（C-4‴），68.1（C-5‴），17.9（C-6‴）。以上光谱数据与文献［4］报道基本一致，因此鉴定化合物2为橙皮苷。

化合物3：黄色粉末，mp 274～275℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：12.45（1H，s，OH-5），8.08（2H，d，J=8.3 Hz，H-2′，6′），6.90（2H，d，J=8.3 Hz，H-3′，5′），6.38（1H，d，J= 1.8 Hz，H-8），6.17（1H，d，J=1.8 Hz，H-6）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：148.2（C-2），137.3（C-3），177.5（C-4），162.7（C-5），99.5（C-6），165.7（C-7），94.6（C-8），158.4（C-9），104.7（C-10），121.9（C-1′），130.8（C-2′，6′），115.5（C-3′，5′），160.8（C-4′）。以上光谱数据与文献［5］报道基本一致，因此鉴定化合物3为山柰酚。

化合物4：白色针状结晶（乙酸乙酯），mp 260～262℃。1H-NMR（CDC13，400 MHz）δ：0.74（3H，s，H-24），0.87（3H，s，H-25），0.89（3H，d，J=6.8 Hz，H-23），0.97（3H，s，H-30），1.00（3H，s，H-29），1.02（3H，s，H-26），1.05（3H，s，H-27），1.22（3H，s，H-28），2.3～2.4（2H，m，H-2）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ：213.2（C=O），22.3（C-1），41.9（C-2），58.3（C-4），42.1（C-5），41.8（C-6），18.8（C-7），51.9（C-8），37.8（C-9），59.7（C-10），35.6（C-11），23.9（C-12），39.3（C-13），38.8（C-14），30.5（C-15），36.3（C-16），32.8（C-17），43.7（C-18），36.0（C-19），28.5（C-20），32.9（C-21），39.5（C-22），16.9（C-23），14.9（C-24），18.5（C-25），17.7（C-26），19.5（C-27），31.7（C-28），34.6（C-29），31.9（C-30）。以上光谱数据与文献［6］报道基本一致，因此鉴定化合物4为木栓酮。

化合物5：淡黄色粉末，mp 269.5～270.5℃。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：6.19（1H，d，J=9.5 Hz，H-3），7.79（1H，d，J=9.5 Hz，H-4），6.95（1H，s，H-5），6.77（1H，s，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：164.4（C-2），113.9（C-3），146.8（C-4），112.5（C-5），144.5（C-6），150.5（C-7），103.8（C-8），152.3（C-9），112.9（C-10）。以上光谱数据与文献［7］报道基本一致，因此鉴定化合物5为6，7-二羟基香豆素。

化合物6：无色针晶，mp 170～172℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.46（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6），6.76（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），7.60（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.29（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：127.9（C-1），131.5（C-2，6），116.8（C-3，5），161.8（C-4），146.9（C-7），115.8（C-8），171.2（C-9）。以上光谱数据与文献［8］报道基本一致，因此鉴定化合物6为反式-对香豆酸。

化合物7：无色片状晶块（甲醇），mp 165.0～167.0℃。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：1.61（1H，m，H-1），2.26（1H，m，H-2），2.41（1H，m，H-2），2.54（2H，m，H-6），2.59（1H，m，H-1），2.94（1H，m，H-5），3.98（1H，m，H-5），4.60（1H，t，J=7.8 Hz，H-10b），6.52（1H，s，H-7），6.54（1H，s，H-10）。13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：27.7（C-1），31.6（C-2），172.4（C-3），36.9（C-5），27.6（C-6），123.8（C-6a），115.7（C-7），144.3（C-8），144.5（C-9），112.0（C-10），128.7（C-10a），55.9（C-10b）。以上光谱数据与文献［9］报道基本一致，因此鉴定化合物7为金莲花碱。

化合物8：淡黄色粉末，mp 207～209℃。1HNMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.05（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），6.77（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.95（1H，dd，J=2.0，8.2 Hz，H-6），7.50（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），6.18（1H，d，J=16.0 Hz，H-8）。13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δ：128.4（C-1），115.7（C-2），147.6（C-3），149.9（C-4），117.1（C-5），123.5（C-6），147.4（C-7），115.8（C-8），167.8（C-9）。以上光谱数据与文献［10］报道基本一致，因此鉴定化合物8为咖啡酸。

化合物9：白色粉末，mp 90.5～91.0℃，不溶于无机酸，易溶于碱，推测为脂肪酸；EI-MS m/z87，101，115，129，157，171，185，213，227，255，297，311，325，339，353，367，424；与二十八烷酸对照品TLC的Rf值一致。其光谱数据与文献［11］报道基本一致，因此鉴定化合物9为二十八烷酸。

3.2化合物对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗的影响 本实验对分离得到的各个化合物进行了抗糖尿病的初步活性测定，利用胰岛素抵抗的HepG2细胞为体外模型，测定化合物1～9对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响，结果如图1所示，化合物1～4能够有效地促进胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗，其中化合物1的作用最为显著。根据初步活性结果，确定了EC50的浓度测定范围，对化合物1进行了EC50浓度测试，测试浓度分别为（1μmo1/L、5μmo1/L、10μmo1/L、50μmo1/L、100μmo1/L），其EC50值为12.67μmo1/L。

3.3化合物1对胰岛素抵抗HepG2细胞Akt磷酸化水平的影响 蛋白激酶B（Akt/PKB）是一种重要的蛋白激酶，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程，它在西部代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要作用，与胰岛素抵抗的发生发展密切相关［12］。本实验利用胰岛素抵抗的HepG2细胞，测定化合物1在浓度分别为1、5、10μmo1/L时对胰岛素抵抗状态下HepG2细胞蛋白激酶B（Akt/PKB）的磷酸化水平的影响，实验结果如图2所示，化合物1在不影响Akt总蛋白表达的前提下能够显著降低胰岛素抵抗HepG2细胞Akt的磷酸化水平，并呈现剂量依赖性，显示化合物1可能通过降低Akt磷酸化水平来改善HepG2细胞的胰岛素抵抗状态从而提高葡萄糖消耗，提示化合物1具有一定的抗糖尿病活性。

图1　化合物1～9对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响Fig.1　Effect on gIucose consum ption of compounds1-9 in insu Iin resistance HepG2 ceIIs

4　讨论

本实验从马齿苋石油醚和乙酸乙酯极性部位提取分离得到9个化合物，其中化合物1为首次从该植物中分离得到。根据马齿苋的现代药理学研究结果以及文献报道黄酮及黄酮苷类化合物具有显著的抗糖尿病活性［13-14］，利用胰岛素抵抗HepG2细胞对化合物1～9进行抗糖尿病作用的初步筛选，初步筛选结果表明，黄酮类化合物1～4能够有效地提高胰岛素抵抗的HepG2细胞葡萄糖消耗量，其中化合物1的效果最为显著；进一步对Akt磷酸化水平评价表明，化合物1能剂量依赖性的降低胰岛素抵抗HepG2细胞Akt磷酸化水平，改善胰岛素抵抗，提高细胞对葡萄糖的利用，显示了明确的体外抗糖尿病作用。本实验利用胰岛素抵抗的HepG2细胞模型对马齿苋的抗糖尿病活性进行了初步研究，为中药马齿苋的抗糖尿病应用提供了实验依据。

图2　不同浓度化合物1对胰岛素抵抗HepG2细胞Akt磷酸化水平的影响Fig.2　Effect of compound 1 w ith different concentrations on the phosphoryIation IeveIof Akt of insu Iin resistance HepG2 ceIIs

［1］贺圣文，刘同善，尤 敏，等.马齿苋对家兔实验性高脂血症的防治作用［J］.中草药，1997，28（4）：221-223.

［2］丁怀伟，姚佳琪，宋少江.马齿苋的化学成分和药理活性研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2008，25（10）：831-838.

［3］Pan Y X，Zhou C X，Zhang SL，et al.Constituents from Ranunculus sieboldii Miq［J］.JChin Pharm Sci，2004，13（2）：92-96.

［4］张正付，边宝林，杨 健，等.茉莉根化学成分的研究［J］.中国中药杂志，2004，29（3）：237-239.

［5］迟 祥，郭美丽，宋 慧，等.鸡冠花种子的化学成分研究［J］.吉林农业大学学报，2010，32（6）：657-660.

［6］林连波，符小文，艾朝晖，等.海南山苦茶叶的化学成分研究（I）［J］.中国中药杂志，2006，31（6）：477-479.

［7］张 龙，周光雄，李 茜，等.狭基线纹香茶菜的化学成分［J］.沈阳药科大学学报，2006，23（12）：768-770.

［8］杨丽娟，羊晓东，李 良.藏药云南兔耳草的化学成分研究［J］.中草药，2005，28（9）：767-768.

［9］姚佳琪，孟 娜，宋少江，等.马齿苋的化学成分［J］.沈阳药科大学学报，2007，24（12）：727-753.

［10］刘雪润，陈 重，李笑然，等.紫玉盘叶的化学成分研究［J］.中草药，2011，42（11）：2197-2199.

［11］向 兰，范国强，郑俊华，等.窄叶大黄非蒽醌类成分研究［J］.中国中药杂志，2001，26（8）：551-554.

［12］常 盛.PI3K/Akt信号通路与胰岛素抵抗的研究进展［J］.中医药导报，2008，14（7）：113-115.

［13］Liu JF，Ma Y，Wang Y，etal.Reduction of1ipid accumu1ation in HepG2 ce11s by 1uteo1in is associated with activation of AMPK and mitigation of oxidative stress［J］.Phytother Res，2011，25（4）：588-596.

［14］ZhangW Y，Lee JJ，Kim IS，et al.7-O-methy1aromadendrin stimu1ates g1ucose uptake and improves insu1in resistance in vitro［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（9）：1494-1499.

Anti-diabetic constituents of Portulaca oleracea L.

JIN Yan， XU Hua-ying， CHEN Chen
（The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China）

AIM To study the chemica1constituents from Portulaca oleracea L.and their anti-diabetic activity.METHODS The constituents extracted from P.oleracea with 75%ethy1a1coho1were iso1ated by chromatography of si1ica ge1，ODS，Toyopear1HW-40 and preparative HPLC.Their structureswere identified on the basis of the physica1properties and spectra1 ana1ysis.Furthermore，the anti-diabetic activities were eva1uated by g1ucose consumption assay and the effect on Akt phosphory1ation in insu1in-resistance HepG2 ce11s.RESULTS Nine compounds were iso1ated from P.oleracea L.and identified as apigenin-4′-O-α-L-rhamnopyranoside（1），hesperidin（2），kaempfero1（3），friede1in（4），6，7-dihydroxycoumarin（5），E-p-coumatic acid（6），tro11isine（7），caffeic acid（8），O ctacosanoic acid（9），and compounds1-4 had significant1y stimu1ated g1ucose consumption in insu1in resistance HepG2 ce11s，especia11y compound 1，and decreased their Akt phosphory1ation.CONCLUSION Compound 1 is iso1ated from P.oleracea L.for the first time and exhibits remarkab1e anti-diabetic activity.

Portulaca oleracea L.；f1avonoid g1ycoside；apigenin-4′-O-α-L-rhamnopyranoside；antidiabetic activity

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0124-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.025

2014-02-28

金 妍（1986—），女，药师，从事药房工作。Te1：13920294947，E-mai1：386831119@qq.com