达原饮解热作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析

任慧玲，　严 彪，　梁之桃，　赵中振，　董 燕，　张 健*

（1.苏州大学药学院，江苏　苏州　215123；2.香港浸会大学中医药学院，中国　香港　999077）

达原饮解热作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析

任慧玲1，严 彪1，梁之桃2，赵中振2，董 燕1，张 健1*

（1.苏州大学药学院，江苏苏州215123；2.香港浸会大学中医药学院，中国香港999077）

目的 研究达原饮对LPS诱导的大鼠发热模型的解热作用及其机制，采用UPLC/Q-TOF-MS法分析达原饮乙醇提取物中的化学成分。方法 大鼠腹腔注射脂多糖（LPS）建立发热模型，药物处理后连续监测体温8 h，观察大鼠体温变化；运用酶联免疫试剂盒检测血清IL-6、TNF-α水平，MPO试剂盒检测肝组织MPO活性。采用UPLC/Q-TOF-MS法，分析达原饮乙醇提取物的化学成分。结果 达原饮对LPS引起的大鼠发热具有明显的解热作用，显著降低血清中TNF-α、IL-6水平及肝组织中的MPO活性。正离子模式下检测出达原饮乙醇提取物中48个化合物。结论 达原饮具有显著的解热作用，其作用机制与降低血清中IL-6、TNF-α水平，降低肝组织中MPO活性有关。通过UPLC/Q-TOFMS分析，达原饮的主要化学成分为黄酮、皂苷、生物碱和有机酸类化合物。

达原饮；解热；脂多糖（LPS）；UPLC/Q-TOF-MS

达原饮出自吴又可所著《瘟疫论》，由槟榔、厚朴、草果仁、知母、芍药、黄芩、甘草七味药物组成，用于瘟疫或疟疾邪伏膜原之憎寒壮热，胸闷呕恶，头痛烦躁，脉弦数，舌边深红、苔垢腻等症，具有开达膜原、辟秽化浊之功［1］。目前，对达原饮临床治疗发热的研究已有多篇报道，但作用机制不明［1-2］。本实验通过建立大鼠发热模型，研究达原饮的解热作用，对其作用机制进行了初步探讨，并采用UPLC-Q-TOF/MS技术，通过与对照品比较，质谱数据分析，参考相关文献初步分析达原饮乙醇提取物的化学成分［3-12］，为进一步探讨达原饮解热功效的物质基础提供依据。

1　解热实验

1.1材料和试剂

1.1.1动物 SPF级雄性SD大鼠50只，合格证号NO.SCXK（苏）2009-0001。体质量（200±10）g，自由饮食饮水，环境温度控制于（28±0.5）℃。

1.1.2药物及试剂 各味药材均购买于苏州市天灵中药饮片有限公司（药材提取物干燥后，混悬于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中）；羧甲基纤维素钠800～1200（国药集团化学试剂有限公司）；阿司匹林（南京白敬宇制药有限责任公司，国药准字H32026500）；脂多糖LPS 055：B5 L2880（Sigma公司）；MPO测试盒（南京建成赛浩科技有限公司）；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（上海船夫贸易有限公司）；实验用水为双蒸水，生理盐水。

1.1.3仪器 BT-A21型电子体温计（深圳市福达康实业有限公司东莞分公司）；EL303电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；ME215P-OCE电子天平（德国Sartorius AG公司）；TGL-16B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；ELx800酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；DL-360A超声波清洗器（上海科岛超声仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1药物的制备

1.2.1.1阿司匹林混悬液的配制 0.59 g/片，2片药加50 mL生理盐水，用玻棒捣碎，置于水浴振荡器上震荡溶解，过滤，制成20 mg/mL溶液，封口，灭菌，冰箱保存备用；将LPS溶于无菌生理盐水中，配成质量浓度为20μg/mL的溶液。

1.2.1.2达原饮水提物制备 称取槟榔（BL）28.6 g，厚朴（HP）14.3 g，知母（ZM）14.3 g，白芍（BS）14.3 g，黄芩（HQ）14.3 g，草果（CG）7.1 g，甘草（GC）7.1 g，用500 mL水提取，回流2 h，提取2次，合并，减压浓缩干燥得达原饮水提物。

1.2.1.3达原饮乙醇提取物制备 称取同样质量各味药材，加入500 mL 95%乙醇回流提取2次，合并，减压浓缩干燥得达原饮醇提物。

1.2.2实验分组及给药方法 造模前，每日早晚测量各组大鼠的肛温，连续测定3 d，每次测之前电子体温计探头上涂凡士林，插入大鼠直肠2 cm，选取体温在36.6～38.3℃，且连续体温变化小于0.5℃的大鼠，取其平均值作为正常基础体温。按照体温基础值和体质量均衡随机分成5组（每组10只）：空白组（A）、模型组（B）、达原饮水提物组（C）、达原饮醇提物组（D）、阿司匹林对照组（E）。B、C、D、E组腹腔注射LPS（100 μg/kg），A组注射同体积生理盐水，30 min后，C、D组分别灌胃给达原饮水提物（936 mg/kg）和醇提物（365 mg/kg），相当于生药量4.2 g/kg、E组灌胃给药阿司匹林（200 mg/kg），于给药后1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8 h分别测定肛温，记录各组体温数据，与基础体温比较，计算各时段温差。各时段温差=各时段体温（℃）-基础体温（℃）。

1.2.3炎症因子TNF-α和IL-6的测定 大鼠造模后8 h，眼眶取血，4℃1500×g离心20 min，取上清液备用。按试剂盒说明测定血清TNF-α和IL-6水平，酶标仪上读取OD450。

1.2.4髓过氧化物酶（MPO）活性的测定 严格按试剂盒说明书进行操作，测定460 nm下吸光度（A）。MPO（U/g）=（测定管A-对照管A）/ 11.3×取样量（g）。

1.3结果

1.3.1达原饮对LPS引起大鼠发热模型的解热效应 达原饮对大鼠直肠温度的影响，见图1，空白组大鼠体温在整个过程中体温相对恒定。模型组（B）给予LPS 100μg/kg后，各鼠在3.5～4 h左右出现一个发热峰，部份大鼠还出现不同程度腹泻等症状，C、D、E组分别给达原饮水提物、达原饮醇提物和阿司匹林后，体温明显低于模型组。

1.3.2达原饮对LPS发热大鼠血清TNF-α、IL-6及MPO的影响 结果显示，与空白组相比，模型组在腹腔注射LPS后，血清中IL-6、TNF-α和肝组织中MPO活性明显增加，而达原饮则不同程度地降低TNF-α、IL-6及MPO的活性（P＜0.05），见表1。

图1　达原饮对LPS诱导大鼠发热反应的影响（n=10）Fig.1　Effect of Dayuanyin on body tem perature in LPS-induced fever rats（n=10）

表1　达原饮对发热大鼠血清及肝组织各致热因子的影响（±s，n=10）Tab.1 Effect of Dayuanyin on pyrogenic factors in serum and Iiver tissue of LPS-treated rats（±s，n=10）

表1　达原饮对发热大鼠血清及肝组织各致热因子的影响（±s，n=10）Tab.1 Effect of Dayuanyin on pyrogenic factors in serum and Iiver tissue of LPS-treated rats（±s，n=10）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，ΔP＜0.05

组别MPO/（U·g-1）TNF-α/（pg·mL-1）IL-6/（pg·mL-1）0.70±0.058 5.65±1.40 129.00±21.25模型组1.70±0.27*53.80±10.30*501.67±92.11*达原饮水提物组0.78±0.09Δ16.95±3.82Δ222.67±36.75Δ达原饮醇提物组1.14±0.23Δ34.05±8.45Δ373.67±55.63Δ阿司匹林对照组0.67±0.11Δ5.35±1.73Δ147.67±21.42空白组Δ

2　UPLC-Q-TOF/MS分析

2.1仪器和试药 ACQUITY UPLC/Q-TOF MS系统（美国Waters公司），采用电喷雾电离（ESI），二元高压泵，在线脱气装置，自动进样器，数据采集与处理采用MassHunter软件；UPLC C18分析柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm，ACQUITY UPLC BEH，Waters，USA）；数据采集与处理采用MassHunter软件；所有试剂均为色谱纯（E.Merck，Darmstadt，Germany），水为超纯水系统制备得到（Mi11ipore，Bedford，MA，USA）。

氢溴酸槟榔碱、甘草苷、芒果苷、知母皂苷B-Ⅱ、黄芩苷、芍药苷、厚朴酚、和厚朴酚对照品均购于成都瑾哲生物科技有限公司。

2.2样品和对照品制备 称取槟榔28.6 g，厚朴14.3 g，知母14.3 g，白芍14.3 g，黄芩14.3 g，草果7.1 g，甘草7.1 g，分别用500 mL 95%乙醇提取，回流提取2次。将提取液旋干，用甲醇超声溶解，制成1 mg/mL的供试品溶液。分别称取适量氢溴酸槟榔碱、甘草苷、芒果苷、知母皂苷B-Ⅱ、黄芩苷、芍药苷、厚朴酚、和厚朴酚，加入甲醇配成相应的溶液，量取上述溶液适量，混合均匀，配成含有上述各对照品质量浓度为1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3方法与条件

2.3.1色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱（0～18 min，2%～15%B；18～25 min，15%～35%B；25～30 min，35%～70%B；30～31 min，70%～100%B）；体积流量0.4 mL/min；柱温20℃；进样体积1.0μL。

2.3.2质谱条件 Agi1ent 6540 accurate mass QTOF LC/MS（Agi1ent Techno1ogies，USA）系统，配有电喷雾离子源（正离子模式）和MassHunter数据分析系统，雾化气温度为300℃，雾化气体积流量8.0 L/min，脱溶剂气（N2）体积流量8.0 L/min，毛细管电压为3 500 V（正离子模式），喷嘴电压为500 V，扫描范围m/z 100～1 700。

2.4结果 达原饮乙醇提取物的正离子模式下色谱图见图2，与平衡比较，对比所加对照品的BPC（base peak chromatogram）图谱，参照各个药材的图谱，确定48个共有峰，并对各共有峰进行归属判断，结果显示，峰2、15、16、24、35、45为有机酸类化合物。峰1、4、6、8、14、43为生物碱类化合物，主要来源于厚朴、草果。峰18、36、39为甾体皂苷类化合物，主要来源于知母。峰27、40、41、42、48为三萜皂苷类化合物，主要来源于甘草。峰3、5、10、11、13、17、19、20、21、22、23、26、28、29、30、31、33、34、37、41为黄酮类化合物，主要来源于黄芩。分析各峰的质谱图，依据分子离子峰及碎片离子，参考相关文献［3-12］，确定推测化合物，初步鉴定结果见表2。

图2　BPC图谱Fig.2　Peak numbers refered to base peak chromatogram

续图2 BPC图谱Fig.2　Peak numbers refered to base peak chromatogram

表2　达原饮UPLC-ESI-TOF/MS色谱图中各峰的测定数据和鉴定结果Tab.2 M easurement data and the identification resu Its of Dayuanyin by UPLC-Q-TOF-MS

续表2

3　讨论

解热实验中给予大鼠LPS 100μg/kg腹腔注射后，出现典型三相热，其中以4 h的体温上升最显著，最大幅度达1.4℃，同时伴随寒颤精神萎靡和腹泻等症状，这与临床感染的炎症性发热极其相似。但给予阿司匹林和达原饮治疗后，LPS诱导的三相发热反应显著降低，表明了阿司匹林和达原饮对LPS诱导的大鼠发热反应具有明显抑制作用。MPO是存在于中性粒细胞与巨噬细胞嗜苯胺蓝颗粒中的酶，发生炎症时，可以被活化的中性粒细胞和巨噬细胞所释放；因此，通过测量MPO活性可以间接判断组织炎性细胞浸润程度。实验中发现，模型组在给予LPS 100μg/kg腹腔注射后，大鼠肝组织中MPO活性明显升高，但经达原饮治疗后（实验D、E组），在体温下降的同时肝脏中MPO表达量也明显降低［13］。肿瘤坏死因子（TNF-α）主要由巨噬细胞产生，为内源性炎性致病因子，在炎症反应中起到重要作用［14］；IL-6是一种炎症细胞因子，在发生炎症等情况下，血清中IL-6会显著增加。实验中发现，模型组在给予LPS腹腔注射后，大鼠血清中TNF-α、IL-6水平及肝组织中的MPO活性明显升高，但经达原饮处理后则在体温下降的同时血清中TNF-α、IL-6水平和肝脏中MPO表达量也明显降低。由此推测，达原饮通过抑制外周肝组织炎症反应和降低内源性炎症细胞因子的分泌而产生解热效应。

本实验通过对达原饮解热作用的研究确定了其解热作用，为了进一步确定活性成分，采用了液质联用技术对达原饮乙醇提取物中的化学成分进行了分析，在高效分离的基础上，测定了部分成分的相对分子质量，对达原饮的主要化学成分进行了初步研究。实验结果表明复方达原饮中的化学成分主要为黄酮、皂苷、生物碱和有机酸类。黄芩的主要活性成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和汉黄芩苷等黄酮类化合物，其中，黄芩素和黄芩苷具有一定的解热镇痛抗炎作用，其作用机制主要与抑制PGE2分泌，抑制核因子的活性以及细胞因子的分泌具有密切的关系［15-16］。知母中的知母皂苷B-Ⅱ具有体外抗炎活性，在mRNA和蛋白表达水平可抑制IL-1、TNF-α和IL-6等炎症因子的生成，同时抑制细胞核因子-B（NF-κB）和促细胞分裂剂激活性蛋白激酶（p38MAPkinase）的激活［17］。甘草中的甘草酸、甘草多糖和甘草黄酮类化合物具有抗炎活性［18］。此外，白芍［19］和草果［20］也具有抗炎作用。药理实验结果表明达原饮可能是通过抑制外周肝组织炎症反应和降低内源性炎症细胞因子的分泌而产生解热效应。而达原饮的UPLC-Q-TOF/MS化学成分分析也表明，达原饮含有大量来源于黄芩的黄酮类化合物、及知母中知母皂苷B-Ⅱ等，由此，我们推测达原饮发挥解热作用的化学成分可能主要来源于黄芩中的黄酮类化合物，知母中的知母皂苷B-Ⅱ等。对比各味药与达原饮的色谱图，发现单味药中的许多峰在达原饮中并没有出现，这可能由于这些成分量太低未被检测出。通过对比达原饮水提物和醇提物的液相色谱图，发现醇提物与水提物所含化学成分总数基本一致，而且醇提物含有量较水提物高，有利于准确推断可能的有效成分，因此采用UPLC-Q-TOF/MS分析其乙醇提取物中的化学成分。目前，课题组正在对达原饮水提物进行处理，将利用UPLC-Q-TOF/MS技术结合药理实验，进一步确定达原饮的解热活性部位，分析其药效成分。

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AntifebriIe effect of Dayuanyin and its determ ination by UPLC/Q-TOF-MS

REN Hui-1ing1， YAN Biao1， LIANG Zhi-tao2， ZHAO Zhong-zheng2， DONG Yan1， ZHANG Jian1*
（1.College of Pharmaceutical Science，Soochow University，Suzhou 215123，China；2.School of Chinese Medicine，Hong Kong Baptist University，Kowloon，Hong Kong Special Administrative Region，999077，China）

AIM To observe the effect of Dayuanyin on LPS-induced febri1e response in rats and e1ucidate the antipyreticmechanism of Dayuanyin，and to ana1yze the chemica1 composition in ethano1 extract of Dayuanyin by UPLC/Q-TOF-MS.M ETHODS Fever was induced by intraperitonea11y injecting LPS（100μg/kg），and the temperaturewas observed for8 h，and the changes of temperaturewere observed.IL-6，TNF-α1eve1s and 1iver tissue MPO 1eve1s in ce11supernatantwere detected.Chemica1compositions of Dayuanyin were ana1yzed by UPLC/QTOF-MS.RESULTS Dayaunyin had significant antipyretic effect on rats induced by LPS，cou1d reduce the 1eve1 of TNF-αand IL-6 in serum，and decrease the activity ofMPO in 1iver tissue.Forty-eight compounds in the ethano1 extract of Dayuanyin had been detected in the positive ionmode.CONCLUSION Dayaunyin has significant antipyretic effect by decreasing the 1eve1of IL-6 and TNF-αin serum and reducing the contentof MPO in 1iver tissue. Ana1yzed by UPLC/Q-TOF-MS，themain chemica1compositions of Dayuanyin are f1avonoids，saponins，a1ka1oids，organic acids.

Dayuanyin；antipyretic effect；1ipopo1ysaccharide（LPS）；UPLC/Q-TOF-MS

R284.1

A

1001-1528（2015）01-0131-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.027

2014-01-16

江苏省优势学科项目资助（2011）

任慧玲（1991—），女，硕士生。Te1：15295673203，E-mai1：renhui1ing91@163.com

张 健（1975—），女，博士，副教授，从事天然药物活性研究。Te1：13814875226，E-mai1：jianzhang@suda.edu.cn