醋蒸对南五味子木脂素类成分在大鼠肝脏分布的影响

邓 翀，　郑 洁，　姜 祎，　宋小妹

（1.陕西中医学院药学院，陕西　咸阳　712046；2.汉中市3201医院，陕西　汉中　723000）

［饮片炮制］

醋蒸对南五味子木脂素类成分在大鼠肝脏分布的影响

邓 翀1，郑 洁2，姜 祎1，宋小妹1

（1.陕西中医学院药学院，陕西咸阳712046；2.汉中市3201医院，陕西汉中723000）

目的 考察醋蒸对南五味子木脂素类化学成分在大鼠肝脏代谢的影响。方法 给大鼠分别灌服醋蒸和未醋蒸南五味子乙醇提取物，HPLC法测定不同时间点大鼠肝脏组织中的五味子酯甲和五味子甲素.采用DAS 2.0药物代谢动力学分析软件计算它们的药代动力学参数，相对摄取率和峰浓度比。结果 和未醋蒸南五味子生品组比较，醋蒸南五味子的五味子酯甲和五味子甲素达峰时间较晚，半衰期延长，在肝脏的平均滞留时间明显延长，Ka变小；另外，五味子酯甲和五味子甲素的相对摄取率和峰浓度比均大于1。结论 醋蒸过程延长南五味子中木脂素类成分在肝脏的滞留时间与南五味子“醋制入肝”的中药炮制理论相一致。

醋蒸；南五味子；木脂素；五味子酯甲；五味子甲素；肝脏分布；大鼠

南五味子是木兰科植物华中五味子Schisandrasphenanthera Rehd.Et Wi1s的干燥果实，传统功效为收敛固涩、益气生津、补肾宁心等［1］。现代研究表明，南五味子的主要活性成分包括五味子甲素、五味子酯甲等联苯环辛烯类木脂素，并以五味子甲素、酯甲为主，对肝炎有较好的降低血清谷丙转氨酶作用，临床应用广泛［2-5］。另一方面，中药传统炮制理论有“醋制入肝”之说，醋制引药入肝经，南五味子醋制可增强其降酶保肝的功效［6-7］。基于此，本研究以醋蒸炮制前后饮片为研究对象，考察其主要活性化学成分五味子酯甲和五味子甲素在大鼠肝脏分布代谢特征，为进一步阐明醋蒸五味子“醋制入肝”炮制理论提供参考依据。

1　仪器与试药

1.1仪器和试剂 高效色谱仪（L-2130双泵，L-2400检测器，日本日立）；GB2042电子天平（瑞典萨多利斯公司）；LG15-W离心机（上海医用离心机厂）；涡旋混合仪（上海泸西分析仪器有限公司）；五味子酯甲﹙批号11529-200503）、五味子甲素（批号110764-200609）对照品均购自中国药品生物制品检定所；乌来糖（中国国药集团化学试剂有限公司，批号WS20050411）；乙腈和甲醇均为色谱纯；水为重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

1.2实验动物 SD大鼠，7～8周龄，雌雄各半，清洁级，体质量约（220±20）g，购自西安交通大学动物实验中心（合格证2007-01）。

2　方法与结果

2.1对照品和受试药物的配制 精密称取南五味子醋制前后样品粉末（60目筛）约500 g，16倍量55%乙醇回流提取2次，每次60 min，滤过，合并提取液浓缩至干［8］。经检测南五味子炮制前干膏样品五味子酯甲含有量为0.832%，五味子甲素含有量为0.929 8%；炮制后干膏样品五味子酯甲为0.895 1%，五味子甲素为0.990 3%（五味子酯甲和五味子甲素含有量是以生药量进行计算）。

精密称定5.64 mg五味子酯甲、6.08 mg五味子甲素，分别放置于25 mL量瓶中，95%乙醇溶解，然后定容至刻度，五味子酯甲和五味子甲素对照品溶液质量浓度分别为0.225 6、0.243 2 mg/mL。

2.2样品处理 精密称取肝组织约2.0 g，加入4.0 mL生理盐水破碎匀浆，制成质量浓度为50%的肝组织匀浆液。精密量取肝组织匀浆液1.0 mL，放置到容积5 mL的圆底离心管里，先加入0.1 mL三氯乙酸，再加入2 mL乙醚进行提取，涡旋混合1 min，超声1 min，以3 500 r/min离心10 min，分取上清液（乙醚层），沉淀部分再重复加入2 mL乙醚，按照上述步骤，一共用乙醚萃取3次，合并乙醚层。乙醚层用氮气吹干（37℃），残渣加0.2 mL甲醇复溶，以10 000 r/min离心10.0 min，然后进样20μL进行HPLC分析。

2.3色谱条件 依利特ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～35min，55%～65%A；35～50 min，65%～70%A；50～65 min，70%～80%A）；体积流量0.8 mL/min；检测波长230 nm。

2.4分析方法的确证

2.4.1方法的专属性及检测限 分别取1.0 mL空白对照肝组织液，混合对照品加空白对照肝组织液，大鼠给药后的肝匀浆样品（炮制前、后），按照“2.2”项方法处理样品，进样分析得色谱图1。结果表明，组织中的内源性物质对五味子酯甲和五味子甲素的测定不干扰。

图1　肝组织匀浆中的五味子酯甲和五味子甲素色谱Fig.1　Chromatograms of schisantherin and deoxyschizandrin in Iiver homogenate

2.4.2 标准曲线制备 取6份空白肝匀浆（每份1.0 mL），分别置于5 mL离心试管中，均加入适量五味子酯甲和五味子甲素混合对照品溶液，使匀浆液中五味子酯甲的质量浓度分别为12.16、6.08、2.432、1.216、0.608、0.304μg/mL，五味子甲素的质量浓度分别为11.28、5.64、2.256、1.128、0.564、0.282μg/mL，按照“2.2”项方法处理混合肝匀浆样品，并在“2.3”项色谱条件下进样10μL进行分析，采集色谱图数据。把肝匀浆中五味子酯甲质量浓度Ⅹ（μg/mL）对色谱峰面积Y作线性回归，得标准曲线方程Y= 1 588 787 761Ⅹ+29 806，r=0.999 3，线性范围为12.16～0.304μg/mL。以肝匀浆中五味子甲素质量浓度Ⅹ（μg/mL）对色谱峰面积Y作线性回归，得标准曲线方程：Y=233 168Ⅹ+65 550，r= 0.999 3，线性范围为11.128～0.282μg/mL。

2.4.3精密度 取空白肝组织匀浆液加入适量五味子酯甲和五味子甲素混合对照品溶液，配制成高、中、低3个质量浓度，肝组织匀浆液中五味子酯甲的质量浓度分别为6.08、2.432、0.608 μg/mL，肝组织匀浆液中五味子甲素的质量浓度分别为5.64、2.256、0.564μg/mL。

在1 d内按“2.3”项色谱条件每一质量浓度重复测定5次，计算出五味子酯甲的日内RSD分别为1.4%、1.8%、1.8%，五味子甲素日内RSD分别为0.7%、1.4%、0.9%。5 d内分别相继重复测定5次上述3个质量浓度的肝组织样品，先算出每一天的均值，再以5 d的平均值来计算出五味子酯甲的日间RSD分别为1.0%、2.1%、2.4%，五味子甲素日间RSD分别为1.0%、1.9%、1.8%。

2.4.4提取回收率和方法回收率 取低、中、高3个质量浓度的质控样品（质量浓度见“精密度”考察），每一质量浓度制备5份生物样本，按“生物样品处理”项下方法操作，进样分析得到各成分色谱峰面积A；再取上述相应等质量浓度的混合对照品溶液，直接进样分析得到色谱峰面积B，A与B的比值为提取回收率。根据当日标准曲线计算的质控样品质量浓度与配制生物样品质量浓度进行比较，得到相对回收率。低、中、高3个质量浓度肝组织匀浆液中五味子酯甲和五味子甲素的提取回收率均在70.1%～92.6%之间，五味子酯甲和五味子甲素方法回收率均在87.2%～109.4%之间。RSD在15.0%以内，表明检测方法稳定可行。

2.4.5稳定性 取低、中、高3个质量浓度的质控样品（质量浓度见“精密度”考察），每一质量浓度制备5份生物样本，各质量浓度样品在-20℃冰箱中保存14 d，室温下放置4 h反复冻融2次。按照“2.2”项方法处理混合肝匀浆样品后室温下放置8 h后，测定生物样本中五味子酯甲和五味子甲素含有量。稳定性结果表明，样品中五味子酯甲和五味子甲素在上述条件下稳定性良好，各组的RSD均小于10%，五味子酯甲和五味子甲素方法回收率均在87.2%～109.4%之间。

2.5实验方案 本实验中参考的成人（以60 kg计）临床用量为0.1 g生药/（kg·d），大鼠的用量为10 g生药/（kg·d），相当于成人临床用量的100倍（前期预试结果）。提取物用0.5%的CMC-Na溶液配制成混悬液口服给药。实验分3组，即为：空白对照组、炮前给药组和炮后给药组。南五味子炮制前样品等同给予五味子酯甲的量为83.2 mg/kg，五味子甲素的量为92.98 mg/kg；炮制后样品相当给予五味子酯甲的量为89.51 mg/kg，五味子甲素的量为99.03 mg/kg。

炮制前后各给药组按各自给药剂量口服给药，分别在服药后的0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、24 h时间点以10%乌来糖溶液麻醉动物（每一时间点平行取样动物数为5只），腹部剖取肝组织，以生理盐水洗去组织表面血渍，滤纸吸干表面水分，保存于-80℃冰箱待测。

2.6药代动力学研究结果 以五味子酯甲和五味子甲素含有量为指标，监测不同时间点的肝匀浆药时浓度，计算出南五味子炮制前给药组和炮制后给药组各时间点下的肝匀浆药时浓度平均值，结果见图2。采用药物代谢动力学分析软件（DAS ver2.0版），来分析处理炮制前给药组和炮制后给药组不同时间点的肝匀浆平均浓度值，权重参数为1，计算出其药代动力学参数，结果见表1。

2.7结果分析 Re用来反映同一器官或组织中2种不同制剂的分布情况，计算公式：Re=（AUCi）实验/（AUCi）对照，即同一器官或组织中实验组和对照组的AUC之比。若Re＞1，表示药物在该器官或组织中具有靶向性，反之则不具有靶向性［9］。Re值越大则靶向效果越好。Ce反映每个组织或器官的药物分布的差异性，计算公式：Ce=（Cmax）实验/（Cmax）对照，Ce值越大，代表药物分布差异越大［10］。Ce和Re均大于1，就说明药物在该组织中分布量多［11］。结果见表2。

图2　炮制前给药组和炮制后给药组中五味子酯甲和五味子甲素的药-时曲线比较Fig.2　Mean Iiver concentration-time curves of schisantherin and deoxyschizandrin after intragastric adm inistration of pre-processed and processed drug group

表1　五味子酯甲和五味子甲素的平均药动学参数Tab.1 Average pharmacokinetic parameters of schisantherin and deoxyschizandrin

表2　五味子酯甲和五味子甲素在肝组织中的相对摄取率（Re）、峰浓度比（Ce）Tab.2 ReIative uptake rate（Re），ratio of peak concentration（Ce）at Iiver tissue of schisantherin and deoxyschizandrin

3　讨论

本实验研究发现，大鼠口服给予南五味子生品后，肝组织在30 min可检测出五味子酯甲和五味子甲素，说明五味子酯甲和五味子甲素到达大鼠肝脏速度较快。比较五味子酯甲和五味子甲素在生品组和醋制组中的各项药代动力学参数可知：和南五味子生品组比较，醋制组药物达峰时间（Tmax）较晚，半衰期（t1/2）延长，在肝脏的平均滞留时间（MRT）明显延长，Ka变小；这些参数变化表明醋制过程减慢南五味子中五味子酯甲和五味子甲素在大鼠肝脏的吸收和代谢，延长了南五味子中五味子酯甲和五味子甲素在大鼠肝脏的滞留时间。南五味子醋制组中五味子酯甲和五味子甲素的平均药时曲线下面积（AUC）均大于生品组，表明醋制南五味子的生物利用度高于南五味子生品。另外，从图1可知炮制前后给药组五味子酯甲、五味子甲素在肝内分布过程存在双峰甚至多峰现象，这可能与五味子酯甲、五味子甲素在吸收代谢中存在肝肠循环现象有关［12-13］。

本研究在数据评价方面引入了应用生物药剂学Re和Ce概念和方法，这两个概念可以反映靶向制剂较普通制剂在某一脏器中的药物浓度显著提高直接反映了靶向制剂对某一脏器的靶向性显著优于普通制剂［14］。基于此，本研究以相对摄取率（Re）、峰浓度比（Ce）的概念和方法，比较醋制南五味子中五味子酯甲、五味子甲素相对于其生品而言的相对摄取率（Re）、峰浓度比（Ce）差异，探讨醋蒸过程对南五味子五味子酯甲、五味子甲素肝脏组织分布的影响。实验结果表明，虽然五味子酯甲和五味子甲素的Ce和Re均大于1，但是仅五味子酯甲的Re较大，而五味子酯甲Ce和五味子甲素的Ce和Re分别为1.060±0.287、1.081±0.385、1.133±0.217，均与1差异不大，说明醋制炮制过程主要增强南五味子中五味子酯甲在肝脏分布，但对五味子甲素在肝脏的分布也有一定影响。本研究结果体现醋制对南五味子化学成分肝脏代谢规律有一定的影响，从而为探讨南五味子“醋制入肝”炮制理论提供方法学参考。也将为建立归经理论与药物靶向性分布相结合研究方法探讨中药“醋制入肝”的炮制原理，从而为科学诠释“醋制入肝”中药炮制理论提供研究思路和启示。

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The steaming Kadsura Japonica with vinegar on distribution of Iignans in Iiver of rat

DENG Chong1， ZHENG Jie2， JIANG Yi1， SONG Xiao-mei1
（1.Shaanxi University of Chinese Medicine，Ⅹianyang 712046，China；2.3201 Hospital in Hanzhong City，Hanzhong 723000，China）

AIM To study the effects of steaming Kadsura Japonicaon with vinegar on the metabo1ism of 1ignans in rat 1iver.METHODS Ratswere fed with ethano1ic extracts of steamed Kadsura Japonica with vinegar or ethano1ic extracts of Kadsura Japonica，and their 1iver tissues were co11ected at different time and the contents of schisantherin and deoxyschizandrin weremeasured by HPLC.The DAS 2.0 drug pharmacokinetic ana1ysis software was used to ca1cu1ate pharmacokinetic parameters，re1ative uptake rate and the peak concentration ratio.RESULTS Comparing the Kadsura Japonicaon without vinegar steaming，the contents of schisantherin and deoxyschizandrin reached peak time 1ater，ha1f-1ife and the average residence time in the 1iverwere extended with sma11er Ka.Additiona11y，both the re1ative uptake rate and the peak concentration ratio of schisantherin and deoxyschizandrin were 1arger than 1.CONCLUSION The process of steaming Kadsura Japonica with vinegar that cou1d extend the residence time of 1ignans is tune with the TCM concept of“steaming with vinegar he1p enter 1iver”.

steamingwith vinegar；Kadsura Japonicaon；1ignans；schisantherin；deoxyschizandrin；1iver distribution；rat

R283.1

A

1001-1528（2015）01-0145-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.030

2013-12-26

国家自然科学基金项目（30902002，81374028）；陕西省中医药管理局项目（13-ZY014）；陕西省重点科技创新团队计划（2013KCT-26）

邓 翀（1978—），博士，副教授，研究方向：中药炮制化学及中药炮制原理。Te1：（029）38185165，E-mai1：fmmudz217@ 126.com