莴苣苷B对脑缺血大鼠小脑和延髓NT-3蛋白表达的影响

孙 娟，　詹合琴，　邵焕霞，　张海芳，　邵立伟

（1.新乡医学院护理学院，河南　新乡　453003；2.新乡医学院药学院，河南　新乡　453003）

莴苣苷B对脑缺血大鼠小脑和延髓NT-3蛋白表达的影响

孙 娟1，詹合琴2*，邵焕霞2，张海芳2，邵立伟2

（1.新乡医学院护理学院，河南新乡453003；2.新乡医学院药学院，河南新乡453003）

目的 探讨莴苣苷B（1actuside B）对脑缺血大鼠小脑和延髓NT-3蛋白表达的影响。方法 采取阻塞大鼠大脑中动脉方法复制脑缺血再灌注损伤模型，并观察莴苣苷B对脑缺血大鼠小脑和延髓组织NT-3阳性细胞数和NT-3蛋白表达的影响。结果 莴苣苷B（25mg/kg）能明显降低大鼠的神经行为学评分，能增加小脑和延髓NT-3神经元数目和其蛋白的表达。结论 莴苣苷B在一定程度上对小脑和延髓组织内源性神经营养因子NT-3具有上调作用，并能够促进其蛋白的表达。

莴苣苷B；脑缺血；小脑；延髓；NT-3蛋白

随着人口老龄化的出现和社会经济的发展，缺血性脑卒中已成为一种严重影响健康的疾病［1］，具有较高的致残率和致死率［2］等危害性。由于脑缺血引起的再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程［3］，因此对其的治疗和预防一直是医学界研究的焦点。目前对脑缺血治疗来说，虽然主要采取药物治疗，但早期进行的溶栓治疗时间窗太窄，在临床上很难掌控［4］，相关研究表明，药物治疗主要倾向于对受损神经细胞的保护［5］，促进受损神经元的再生与修复，减轻再灌注损伤［6］。神经营养因子与中枢神经系统关系密切，具有促进神经元生长发育、突触可塑性、神经传递及轴突生长作用。神经营养因子3（neurotrophin-3，NT-3）是神经营养因子家族的主要成员之一，在一定程度上能促进神经干细胞的分化、神经细胞的生长［7］和靶细胞的存活、生长发育。有国内外学者研究资料表明，NT-3与缺血性脑损伤关系密切［8-9］。

莴苣苷B（Lactuside B），是从河南高翅果菊的地下部分中提取分离出来的一种单体化合物［10］，研究小组前期研究发现该单体化合物能增加Bc1-2/Bax mRNA比值［11］和缩小脑梗死体积，上调海马和纹状体NT-3 mRNA的表达，具有一定的抗脑缺血作用［12］。从而提示莴苣苷B可作为一种抗脑缺血的潜在药物，值得进一步深入研究。本研究旨在从小脑、延髓的角度出发，探讨莴苣苷B对小脑、延髓NT-3蛋白表达的影响，进一步探讨莴苣苷B抗缺血性脑组织损伤作用的机制，为临床实践提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器 莴苣苷B为白色粉末状，纯度＞98%，批号xy1-002，由新乡医学院药学院药化教研室闫福林教授提供；尼莫地平注射液，山东方明药业股份有限公司生产，规格为20 mL∶4 mg，批号1103036；水合氯醛粉剂，天津市瑞金特化学品有限公司生产；PV-6001二步法检测试剂盒和NT-3抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。型号为TT22-HQP-101C的持续恒温冰冻切片机；同济医学院清屏影像公司生产的HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统。

1.2方法

1.2.1制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型 参照Longa线栓方法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型［13］，将事先制备好的直径为0.2 mm，型号为1.5号日本鱼线的阻塞线从颈外动脉经颈内动脉（intema1 carotid artery，ICA）插入到大脑中动脉入口，阻塞线插入长度为2.0 cm，假手术组阻塞线插入颈内动脉长度大约为0.5 cm，其余操作均与各组相同。所有实验动物均阻塞2 h后，把阻塞线球端拉回颈外动脉内进行再灌注，并放实验动物回笼中密切观察。

1.2.2实验动物分组与给药 实验动物购自河南省实验动物中心，采用健康清洁Ⅱ级雄性SD大鼠，体质量范围在280～320 g，动物合格证号为SYXK（豫）2005-0012。实验过程对动物的处理符合中华人民共和国2006年科学技术部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。动物随机被分为6组，分别为假手术组、模型组、阳性药物对照组、剂量为12.5 mg/kg的莴苣苷B低剂量组、剂量为25 mg/kg的莴苣苷B中剂量组和剂量为50 mg/kg的高剂量组，每组6只。所有动物均于缺血2h再灌后开始给药，1日2次给药，给药剂量均按5mL/kg腹腔注射给药。假手术组和模型组分别给予等体积的蒸馏水，阳性对照组给予剂量为1 mg/kg尼莫地平注射液，莴苣苷B低、中、高组分别给予相应剂量的实验药物。每组动物均于再灌注24h后处死。

1.2.3免疫组化二步法染色 处死动物后，分别完整地取出大鼠延髓和小脑组织，同时分别将两部位组织冠状切成三部分，取中间一部分做连续冠状冰冻切片，片厚度为5μm，每间隔5张取1张，每组每例取6张切片放置于-20℃冰箱内保存备用。本实验采用免疫组化二步法检测NT-3免疫阳性反应物的表达。实验切片室温放置30min后，放入4℃丙酮固定10min；用3%H2O2孵育5min，滴加NT-3工作液（1∶200），4℃过夜；然后组织切片滴加生物素羊抗兔IgG和链霉亲和素复合物（1∶200），37℃孵育30min；急用型DAB显色剂显色3min，切片脱水后用中性树胶封片。每张切片随机取上、中、下3个视野进行摄像并进行观察。

1.2.4检测项目

1.2.4.1神经功能缺损评分 动物于处死前再进行一次神经缺失症状评分，来验证所选实验药物的抗脑缺血效果。实验动物在手术清醒后依据Zea-1onga评分法［13］，进行神经缺损症状评分。具体评分参考以下标准：无神经损伤症状和体征为0分；提尾后左侧肢体出现内收、屈曲为1分；爬行时身体向左侧划圈即追尾现象为2分；站立时身体向左侧倾斜为3分；意识丧失，无法自主行走为4分。选取评分在1～3分之间的动物进行实验给药。模型组中0分和4分的动物被剔除，不纳入实验中。

1.2.4.2NT-3蛋白表达检测 在光学显微镜下，分别选择大鼠小脑和延髓组织的阳性神经元来进行观察，NT-3阳性颗粒，颜色呈棕黄色或棕褐色，位置定位于细胞浆。每张切片随机选取上、中、下、左、右5个视野，选取同济医学院清屏影像公司生产的HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统摄像，分析染色阳性细胞数目和相对光密度值［14］。蛋白染色的强度用光密度值来表示，光密度值越大代表其蛋白含有量越高。计数NT-3的阳性细胞数。

2　结果

2.1大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型制备成功的判定

手术实验动物麻醉清醒后，结果发现假手术组动物无神经功能缺损症状，活动正常，其余3组模型组、阳性对照组和莴苣苷-B各剂量组大鼠均出现不同程度的神经缺损表现，比如爬行时向左侧划圈、提尾后左侧前肢屈曲内收、站立时向左侧倾倒和意识丧失等，神经行为学评分在1～4分之间，从而说明本实验大脑中动脉缺血再灌注模型制备成功。

2.2莴苣苷B对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经缺失症状评分的影响 大鼠脑缺血缺血再灌注24h后，模型组动物的神经缺失症状评分均明显增高，与假手术组比较有显著性差异（P＜0.01），莴苣苷B低、中、高剂量组均可降低大鼠的神经行为学评分，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），其中剂量组作用较强，与阳性药物对照组比较有显著性差异（P＜0.05），见表1。

表1　莴苣苷B对缺血性脑损伤大鼠神经缺损症状评分的影响（±s，n=6）

表1　莴苣苷B对缺血性脑损伤大鼠神经缺损症状评分的影响（±s，n=6）

注：与假手术组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性对照药比较，#P＜0.05

组别剂量/（mg·kg-1）时间麻醉清醒后用药24h假手术组-0.00±0.000.00±0.00模型组-3.25±0.46△3.38±0.52△阳性对照组12.88±0.352.25±0.46**莴苣苷B低剂量组12.53.00±0.531.88±0.35**莴苣苷B中剂量组253.13±0.351.38±0.52**#莴苣苷B高剂量组503.25±0.462.25±0.71*

2.3莴苣苷B对大鼠缺血性脑损伤小脑组织NT-3神经元数目和其蛋白表达的影响 结果显示与假手术组相比，模型组NT-3蛋白表达下降（P＜0.01）；莴苣苷-B低、中、高剂量组均能增加小脑NT-3神经元数目和其蛋白的表达，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），其中莴苣苷-B中剂量组作用较好，优于阳性对照药（P＜0.01）。见表2，图1。

表2　莴苣苷B对缺血性脑损伤大鼠小脑NT-3数目和蛋白表达的影响（±s）

表2　莴苣苷B对缺血性脑损伤大鼠小脑NT-3数目和蛋白表达的影响（±s）

注：与假手术组相比，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与阳性对照组比较，ΔΔP＜0.01

组别剂量/（mg·kg-1）NT-3神经元数目/个蛋白表达假手术组-15.46±6.000.11±0.050模型组-14.20±4.280.07±0.02**阳性对照组132.63±6.18##0.09±0.05##莴苣苷B低剂量组12.535.92±2.31##0.08±0.04#莴苣苷B中剂量组2544.83±4.63##ΔΔ0.10±0.04##ΔΔ莴苣苷B高剂量组5031.60±5.19##0.09±0.04##

2.4莴苣苷B对大鼠缺血性脑损伤延髓组织NT-3神经元数目和其蛋白表达的影响 实验显示：（1）NT-3神经元数目表达上：莴苣苷B低、中剂量组均能增加延髓NT-3阳性细胞数，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01），且优于阳性对照药（P＜0.01），其中LM组优于低剂量组，两者相比有显著性差异（P＜0.01）。（2）NT-3蛋白表达：与假手术组相比，模型组NT-3蛋白表达下降（P＜0.01）；莴苣苷B低、中、高剂量组均能增加小脑NT-3蛋白的表达，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），其中莴苣苷B中剂量组作用较好优于阳性对照药（P＜0.01）。见表3，图2。

图1　小脑组织NT-3免疫组化染色图片（×400）

表3　莴苣苷B对缺血性脑损伤大鼠延髓NT-3数目和蛋白表达的影响（±s）

表3　莴苣苷B对缺血性脑损伤大鼠延髓NT-3数目和蛋白表达的影响（±s）

注：模型组NT-3蛋白表达下降，与假手术组相比有显著性差异，aP＜0.01；各用药组与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；莴苣苷B各剂量组与阳性对照组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；莴苣苷B低剂量组与中剂量组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

个蛋白表达假手术组组别剂量/（mg·kg-1）NT-3神经元数目/ 50 33.20±5.43 0.07±0.04 -17.69±6.17 0.12±0.05模型组-15.60±4.50 0.08±0.04阳性对照组1 33.88±6.25*0.11±0.06##莴苣苷B低剂量组12.5 39.92±3.18*#0.09±0.04#ΔΔ莴苣苷B中剂量组25 46.67±4.78*#Δ0.13±0.04##Δ**莴苣苷B高剂量组

图2　延髓组织NT-3免疫组化染色图片（×400）

3　讨论

脑缺血再灌注损伤是持续复杂的病理过程，一方面与脑缺血后产生的血管生成因子、内源性神经保护因子有关［15］，另一方面可能与神经元损伤、自由基损伤、钙离子内流、代谢障碍等相关机制产生“级联反应”的瀑布现象有关。NT-3是神经营养因子家族的主要成员之一，它具有能够维持运动神经元、感觉神经元和交感神经元的功能及促进其存活的作用［16］。有相关资料研究表明，NT-3与脑缺血再灌注损伤关系密切，它对缺血后神经功能康复有促进作用［17］。但NT-3与其他神经生长因子有所不同，脑缺血后表达减少［18］，我们的研究与其基本一致。脑缺血再灌注后引起的损伤主要发生的部位在大脑皮质［19］和海马［20］，因此目前国内、外关于神经营养因子对脑缺血再灌注引起的神经细胞损伤的作用机制主要集中在海马［21］和大脑皮质［22］两个部位的研究上，关于小脑和延髓部位的报道比较少。课题组前期研究初步得知莴苣苷B具有一定的抗脑缺血作用，因此在前期基础上，继续探讨莴苣苷B是否能对脑缺血大鼠小脑和延髓NT-3数目和蛋白表达产生的影响。

小脑是中枢神经系统中的运动结构之一，它不仅能够参与躯体平衡和肌肉张力（肌紧张）的调节，而且还能够参与随意运动的协调。人体的生命中枢的延髓，位于小脑正前方，其作用主要是控制呼吸、心跳、消化等基本生命活动。脑缺血时，小脑皮层和大脑、纹状体、海马等脑组织一样，对缺血敏感，容易导致迟发性神经元死亡［23］的发生。有研究表明，在脑组织中，位于远隔部位的延髓，虽然在缺血损伤时处于正常区，但由于延髓内有呼吸、心血管、吞咽和胃肠等内脏活动的重要中枢，能够促进延髓内脏带产生多种神经递质，从而在形态和功能上来一方面保护前脑未受损的神经元，另一方面使受到损害的神经元得到很大的改善［24］。提示当发生短暂性脑缺血时，小脑和延髓组织同样启动了自身的保护机制来参与受损脑细胞功能的恢复。

本实验研究结果发现，用药24 h后，莴苣苷B低、中、高剂量组均能改善大鼠脑缺血再灌注损伤所出现的神经缺失症状，增加小脑和延髓NT-3阳性神经元数目和蛋白的表达，且莴苣苷B中剂量组的作用效果优于阳性对照药尼莫地平，与前期研究发现的莴苣苷B各剂量组能增加大鼠大脑皮质NT-3基因的比较一致。提示莴苣苷B除了可增加大脑皮质NT-3的表达外，也能通过增加小脑和延髓NT-3神经元数目和蛋白的表达来改善脑缺血的神经元损伤。但是本实验结果显示莴苣苷B高剂量组反而不如中剂量组，提示药物剂量设置可能偏高，下次实验时可降低一个剂量实施。通过本研究证实了莴苣苷B在一定程度上对小脑和延髓组织内源性神经营养因子NT-3具有上调作用，并能够促进其蛋白的表达，进一步阐明了莴苣苷B保护脑缺血的分子机制，这对莴苣苷B的临床开发和应用奠定了坚实的理论基础。

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R966

B

1001-1528（2015）01-0192-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.041

2013-10-10

国家自然科学基金资助项目（81172953）；河南省教育厅自然科学研究项目（2009A310009）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（14A310024）

孙 娟（1982—），女，医学硕士，讲师，主要从事心脑血管药理研究。

詹合琴（1967—），女，医学硕士，副教授，硕士生导师，主要从事心脑血管药理研究。Te1：13781966576，E-mai1：xiaofei1@126.com