飞机草醇提物外用对急性软组织损伤的实验研究

秦树森，　曾春晖，　陈益清，　李先梅，　蔡妮娜，　谭娥玉，　徐明光，　颜 欣，　杨 柯*

（1.广西中医药大学药学院，广西　南宁　530001；2.桂林市妇女儿童医院，广西　桂林　541001）

飞机草醇提物外用对急性软组织损伤的实验研究

秦树森1，2，曾春晖1，陈益清1，李先梅1，蔡妮娜1，谭娥玉1，徐明光1，颜 欣1，杨 柯1*

（1.广西中医药大学药学院，广西南宁530001；2.桂林市妇女儿童医院，广西桂林541001）

目的 研究飞机草对小鼠急性软组织损伤的治疗作用及其可能机制。方法 将动物随机分成空白对照组、模型对照组、阳性对照组、飞机草高、低剂量组，除空白对照组外，其余各组小鼠用重物砸伤造成软组织损伤模型，应用比色法，ELISA法动态测定损伤组织中SOD活性和MDA、PGE2、NO的水平。另于给药后第8天取各组余下10只小鼠损伤肌肉，固定于福尔马林，做病理学观察。结果 飞机草高剂量在试验期间能明显升高重物砸伤后损伤组织SOD活性（P＜0.05），明显降低损伤组织MDA、NO、PGE2水平（P＜0.05），而低剂量仅在给药后第5天明显升高重物砸伤后损伤组织SOD活性（P＜0.05）；明显降低重物砸伤后损伤组织MDA、NO、PGE2水平（P＜0.05）。受损骨骼肌HE染色结果显示飞机草给药后第8天，受损组织炎性反应消失，大量成纤维细胞增殖，断端纤维连接。结论 飞机草可通过提高SOD活性，降低MDA、NO、PGE2水平来发挥对急性软组织损伤的治疗作用。

飞机草；急性软组织损伤；实验研究

飞机草Eupatorium odoratum L.为菊科植物，载于《壮药药材学》［1］，性微辛、温，有小毒，具有散瘀消肿，止血，杀虫功能，主要用于跌打肿痛，外伤出血，旱蚂蝗叮咬出血不止，疮疡肿毒，民间常用于治疗跌打、扭伤等软组织损伤。前期研究发现飞机草具有明显的中枢和外周镇痛作用［2］，针对其主要功能主治，本实验着重研究飞机草对重物砸伤小鼠软组织损伤后改善组织病理变化以及对相应致痛物质和氧化应激相关物质的影响来探讨其抗急性软组织损伤的作用及其机制。

1　材料

1.1药品与试剂 飞机草于2011年8月在南宁市郊采集，经广西中医药大学中药学教研室冼寒梅教授鉴定为菊科植物飞机草Eupatorium odoratum L.的地上部分；正骨水（广西玉林制药集团有限责任公司）；SOD试剂盒、MDA试剂盒、PGE2试剂盒、NO试剂盒、考马斯亮兰试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；苏木色精、曙红Y、冰醋酸、盐酸、二甲苯、无水乙醇均为分析纯，购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2主要仪器 超声匀浆器（宁波新芝科器研究所）；全波长酶标仪（美国Epoch Biotek公司）；EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；BX60显微镜（日本OLYMPUS公司）；高速低温离心机（德国Heraeus公司）；HM355 S型全自动石蜡切片机（德国MICROM公司）；TU-1901/1900紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；重物砸伤装置（自制）。

1.3实验动物 昆明种小鼠，雄性，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：scxk桂2009-0003。

2　实验方法

2.1受试药物制备 采集新鲜飞机草地上部分，洗净，阴干，70%乙醇浸泡提取2次，每次用2倍量溶媒浸泡15 d，合并2次滤液，适当浓缩成1 g生药/mL，同时调整酒精体积分数为30%，室温阴凉处放置备用。

2.2动物分组及给药 取雄性健康昆明种小鼠200只，随机分为5组，即空白对照组（不损伤+30%乙醇）、模型组（损伤+30%乙醇）、阳性组（损伤+正骨水）、药物高剂量组（损伤+1g生药/mL 30%乙醇提取物）、低剂量组（损伤+0.5 g生药/mL 30%乙醇提取物），每组40只。软组织损伤模型参考McBrier［3］与吴峻等［4］机械冲击挫伤的造模方法，除空白对照组外，其余各组小鼠在自制砸伤装置用50 g圆形砝码从36 cm高处自由落下砸伤鼠右后肢，24 h后各给药组涂擦相应药液0.5 mL/次，4次/d，每次间隔4 h。空白对照组和模型对照组涂擦等量的30%乙醇，连续7 d。于给药后第2、第5、第8天各组取10只小鼠处死，取适量损伤部位肌肉组织，于-20℃冰箱保存备测SOD活性和MDA、PGE2、NO的水平。另于第8天取各组余下10只小鼠右后肢，固定于福尔马林，做病理学观察。

2.3损伤组织中SOD活性、MDA、NO和PGE2水平的测定 取小鼠受损组织称定质量，加入适量NS制成10%组织匀浆液，严格按照试剂盒说明书进行测定SOD活性，MDA、NO和PGE2水平。

2.4对损伤组织病理学改变的影响

2.4.1样品制备 取固定于福尔马林溶液的右后肢，沿小腿中线向上打开皮肤，然后再打开外层肌肉，暴露腓肠肌，从跟腱处将腓肠肌钝性剥离，取出肌肉组织，然后于0～4℃条件下修剪标本，剔去筋膜及神经组织，按照常规HE染色观察损伤组织病理学改变。

2.4.2病理切片观察指标 骨骼肌组织HE染色后，胞浆呈红色或淡红色，细胞核呈蓝紫色，光学显微镜下观察肌纤维形态和肌纤维断裂情况［5］以及组织的肌细胞形态、结构、排列，明确出血情况，是否有炎性细胞浸润，直接观察到血管损伤程度和新生血管情况等，作为组织损伤后病理生理变化的参考标准。

3　统计学处理

4　结果

4.1对受损组织中SOD活性的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠损伤组织在损伤后第2、第5、第8天的SOD活性显著降低（P＜0.05～0.01）；与模型对照组比较，阳性药正骨水、飞机草高剂量在给药后第2、第5天能明显升高重物砸伤后损伤组织SOD活性（P＜0.05），飞机草低剂量在给药后第5天能明显升高重物砸伤后损伤组织SOD活性（P＜0.05）；给药后第8天，各用药组与模型组比较，差异无显著性（P＞0.05）。结果见表1。

表1　飞机草对小鼠受损组织中SOD活性的影响（±s，n=10）

表1　飞机草对小鼠受损组织中SOD活性的影响（±s，n=10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。下表同

组别剂量/（g·mL-1）SOD活性/（U·L-1）第2天第5天第8天空白组—53.32±18.08**51.86±17.59**57.23±19.41*模型组—26.68±11.5430.69±10.8540.06±15.73阳性组244.00±21.65*48.70±21.13*53.74±23.32飞机草组247.41±27.78*49.16±24.51*54.25±27.05 1 38.55±21.4246.13±18.68*50.90±20.62

4.2对受损组织中MDA水平的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠损伤组织在损伤后第2、第5、第8天的MDA水平显著升高（P＜0.05～0.01）；与模型对照组比较，阳性药正骨水在给药后第2、第5天能明显降低重物砸伤后损伤组织MDA水平（P＜0.05），飞机草高剂量在给药后第2、第5、第8天能明显降低重物砸伤后损伤组织MDA水平（P＜0.05），飞机草低剂量在给药后第5天能明显降低重物砸伤后损伤组织MDA水平（P＜0.05）。结果见表2。

表2　飞机草对小鼠受损组织中MDA水平的影响（±s，n=10）

表2　飞机草对小鼠受损组织中MDA水平的影响（±s，n=10）

组别剂量/（g·mL-1）MDA/（nmo1·g-1）第2天第5天第8天空白组—486.34±232.02**538.86±257.08*502.15±246.50*模型组—982.50±378.15918.61±380.04801.37±349.10阳性组2629.04±251.01*607.98±264.81*558.57±187.56飞机草组2603.61±298.05*560.80±346.11*510.38±140.56*1 768.34±270.01614.33±205.42*572.80±138.70

4.3对受损组织中NO水平的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠损伤组织在损伤后第2、第5、第8天的NO水平显著升高（P＜0.05～0.01）；与模型对照组比较，阳性药正骨水在给药后第2、第5天能明显降低重物砸伤后损伤组织NO水平（P＜0.05），飞机草高剂量在给药后第2、第5、第8天能明显降低重物砸伤后损伤组织NO水平（P＜0.05），飞机草低剂量在给药后第5天能明显降低重物砸伤后损伤组织NO水平（P＜0.05）。结果见表3。

表3　飞机草对小鼠受损组织中NO水平的影响（±s，n=10）

表3　飞机草对小鼠受损组织中NO水平的影响（±s，n=10）

组别剂量/（g·mL-1）NO活性/（nmo1·g-1）第2天第5天第8天空白组—7.07±2.91*7.98±3.29*7.29±2.83*模型组—11.25±3.6012.69±4.0710.88±4.29阳性组28.09±2.46*9.13±2.78*8.02±2.93飞机草组28.06±2.57*9.10±2.91*7.66±1.81*1 9.13±1.699.41±2.50*8.88±2.53

4.4对受损组织中PGE2水平的影响 与空白对照组比较，模型组小鼠损伤组织在损伤后第2、第5、第8天的PGE2水平显著升高（P＜0.05～0.01）；与模型对照组比较，阳性药正骨水、飞机草高剂量在给药后第2、第5、第8天能明显降低重物砸伤后损伤组织PGE2水平（P＜0.05），飞机草低剂量在给药后第5天能明显降低重物砸伤后损伤组织PGE2水平（P＜0.05）。结果见表4。

表4　飞机草对小鼠受损组织中PGE2水平的影响（±s，n=10）

表4　飞机草对小鼠受损组织中PGE2水平的影响（±s，n=10）

组别剂量/（g·mL-1）PGE2/（nmo1·g-1）第2天第5天第8天空白组—376.15±173.91**395.37±175.88**407.21±188.28*模型组—644.86±218.97 729.26±247.63 588.12±191.11阳性组2 422.34±166.69*497.71±209.69*424.22±148.53*飞机草组2 420.05±215.69*455.02±196.99*414.74±152.49*1 514.04±184.53 528.32±146.31*506.50±139.54

4.5对急性软组织损伤小鼠骨骼肌组织病理学的影响 实验结果表明，飞机草对重物砸伤小鼠后腿所致小鼠腿急性软组织损伤有抗炎消肿活血化瘀的作用。空白组动物组织横纹肌横纹清晰，无出血，无病理变化；损伤模型组组织出现血肿，炎性细胞浸润，组织水肿，炎性反应明显；正骨水组组织可见炎性细胞减少，成纤维细胞增殖，肉芽组织增生，疤痕连接，断端纤维连接且间距小；飞机草高剂量组炎性反应消失，大量成纤维细胞增殖，断端纤维连接；低剂量组炎性反应减少，部分成纤维细胞增殖，断端纤维连接。结果见图1。

图1　飞机草对急性软组织损伤小鼠骨骼肌组织病理学的影响（40×）

5　讨论

软组织损伤发病率较高，有文献统计该病在美国的发病率约为21%左右［6］。软组织损伤广泛［7］，其中肌肉组织所占的体积最大，因此其损伤的几率也较高，从10%至55%不等［8］。在组织炎症或损伤刺激下，细胞膜PLA2被激活，水解细胞膜磷脂的酯键，释放的花生四烯酸经COX等酶催化生成大量的PGE2［9］，PGE2除能直接兴奋伤害性感受器，增强和延长组胺、5-HT、缓激肽等致痛因子对神经末梢的致痛作用外，还能提高伤害性感受器的兴奋性，降低其兴奋阈值，使伤害性感受器敏感化，同时还能提高毛细血管通透性，改变其舒缩状态，促进局部炎症性新血管形成，影响疼痛的产生和发展［10-11］。

PG合成同时伴随有大量氧自由基生成，并与PG合成相互促进。氧自由基［12］主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢及其中间产物等。在组织损伤情况下，自由基的产生和清除功能失去平衡，造成氧自由基堆积，进而攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸引起脂质过氧化，形成脂质过氧化产物（LPO），LPO进一步分解为MDA，使其在组织中积聚过多而引起损伤。MDA的水平常常可反映机体内脂质过氧化的程度，并与自由基浓度呈正相关。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。氧自由基在外周和脊髓均有致痛作用，而自由基清除剂如SOD则可以拮抗此致痛作用［13］。

NO是一种重要的炎症介质和免疫分子，具有细胞间和细胞内信使以及神经递质作用，参与许多生理和病理过程。在炎症发展中具有双重作用，一方面通过刺激巨噬细胞诱导受感染细胞的炎症和死亡，另一方面NO由iNOS介导促炎性，表现为促进血管扩张，增强血管壁通透性；与O2-反应可生成毒性更强的ONOO-，加重氧化损伤；诱导促炎性细胞因子；激活前列腺素合成酶等［14］。它不需要任何中介机制而快速地扩散通过生物膜，将一个细胞产生的信息传递到其他周围的细胞中去。大量证据表明NO在外周及中枢的不同水平的痛觉调制中起重要作用［15］。

本实验结果表明飞机草通过增加受损组织SOD活性、降低MDA水平等抗氧化应激途径，以及减少受损组织NO、PGE2等致炎致痛介质来发挥抗急性软组织损伤的作用。

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R285.5

B

1001-1528（2015）01-0196-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.042

2013-10-12

广西中医药管理局资助课题（gzzc1009）

秦树森，硕士生，副主任药师，从事中草药镇痛药理研究。E-mai1：228930028@qq.com

杨 柯，理学硕士，副教授，硕士生导师，从事中药药理学研究。Te1：（0771）2279423，E-mai1：kyang_11@126.com