补中益气汤对A549荷瘤小鼠脾组织Fas蛋白表达的影响

孙志彬，井欢，李璐璐，王哲，刘春英

1.辽宁中医药大学研究生院，辽宁 沈阳110847；2.辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳110847

补中益气汤对A549荷瘤小鼠脾组织Fas蛋白表达的影响

孙志彬1，井欢2，李璐璐1，王哲2，刘春英2

1.辽宁中医药大学研究生院，辽宁 沈阳110847；2.辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳110847

目的：研究补中益气汤对A549荷瘤小鼠脾组织中Fas蛋白表达的影响。方法：建立A549荷瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤实验，采用随机对照法将30只BALB/c小鼠分为正常组、空白对照组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组，除正常组外，余组荷瘤，成功后，每天灌胃相应药物1次，连续10天后取材。采用免疫组织化学检测脾组织中Fas蛋白的表达；逆转录-多聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测脾组织中Fas的mRNA表达。结果：正常组中Fas蛋白在细胞膜有表达，空白对照组出现较多棕黄色颗粒，与正常组比较，Fas表达明显升高（P＜0.01）；补中益气汤及顺铂作用后，Fas蛋白表达减少，与空白对照组比较，中药低剂量组、西药组Fas表达明显下降（P＜0.05），中药高剂量组下降最显著（P＜0.01）。中药高剂量组、中药低剂量组、西药组比较，Fas表达无明显变化（P＞0.05）。与正常组比较，空白对照组Fas的mRNA的表达量明显增加（P＜0.01）；经补中益气汤及顺铂作用后，FasmRNA的表达减少，中药高剂量组、中药低剂量组及西药组与空白对照组的差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），而该3组的FasmRNA的表达与正常组无明显差异。结论：补中益气汤可下调A549荷瘤小鼠脾脏中Fas蛋白的表达，从而促进机体免疫系统对肺癌细胞的杀伤。

补中益气汤；Fas蛋白；A549细胞株；脾组织

Fas是体内介导细胞凋亡的糖蛋白分子，除维持正常生理功能与生存繁殖外，在恶性肿瘤的发生发展中也有显著意义［1］。补中益气汤可用于晚期肺癌的患者，现代药理实验研究表明，其中成分非常复杂，可调节免疫功能［2］，有改善肺部通气，治疗癌性发热，缓解癌性疼痛，调节精神状态等作用［3］。本实验旨在研究补中益气汤对荷瘤小鼠脾组织免疫分子Fas水平的影响，从分子水平探讨补中益气汤调节机体免疫功能从而达到抗肿瘤效果的机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞SPF级BALB/c小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：scxk（京）2011-0011；人肺腺癌A549细胞株由中国医科院肿瘤研究中心细胞库提供。

1.2 仪器与试剂Fas抗体购于武汉博士德（批号：08G02）；RIPA裂解液购于北京鼎国（批号：WB-0071）；荧光定量PCR仪购于ABI公司。

1.3 药物 顺铂注射液（DDP，生产批号2030132DB山东齐鲁医药公司）；补中益气汤方（黄芪、白术、陈皮、升麻、柴胡、人参、甘草、当归）购于辽宁省中医院。

1.4 制备补中益气汤煎剂 根据《中华人民共和国药典》中规定补中益气汤的用药剂量（处方：黄芪18 g，白术、甘草各9 g，陈皮、升麻、柴胡、人参各6 g，当归3 g），并通过《人和动物之间按体表面积折算的等效剂量比值表》，计算出小鼠等效剂量，分设高、低剂量，即5.82 g/kg（生药）、1.46 g/kg（生药）常规煎煮，煎至终浓度为每毫升含生药2.33 g，常规煎煮3次，浓缩成1 kg/L的补中益气汤煎液，4℃冰箱保存备用。

1.5 动物分组与处理BALB/c小鼠30只，随机分成5组，每组6只（雌雄各半）。除正常组外，其余小鼠均于腋下注射A549细胞悬液0.2m L（密度为2×108/L），5天后，观察小鼠腋下有米粒状突起，开始用药。具体用量为：正常组：生理盐水灌胃，0.5m L/只，每天2次，连续10天；空白对照组：生理盐水灌胃，0.5m L/只，每天2次，连续10天；中药低剂量组：低剂量补中益气汤灌胃，0.5m L/只，每天2次，连续10天；中药高剂量组：高剂量补中益气汤灌胃，0.5m L/只，每天2次，连续10天；西药组：顺铂腹腔注射，1.38m g/m2，每天1次，连续3天。于第10天，灌胃后2 h取材。

1.6 免疫组化测定各组脾组织Fas蛋白的表达 组织块石蜡包埋后切片，常规脱蜡至水，EDTA抗原热修复（95℃水浴30 min），3%过氧化氢灭活内原性过氧化物酶20m in，10%山羊血清封闭20m in，滴加一抗，4℃冰箱过夜，取出后恢复至室温，二抗作用30m in，DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗返蓝，脱水，中性树胶封片。结果判定：以细胞核周围出现棕黄色颗粒为阳性。应用图像分析系统记录各自的平均光密度值，作为蛋白表达的量化指标。

1.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法测定各组脾组织Fas的mRNA表达 按照试剂盒说明书采用Trizol一步法，提取总RNA，逆转录成cDNA。Fas引物序列：上游引物5'-GAATG CAAGGGACTGATAGC-3'，下游引物5'-TGGTTCGTGTGCA AGGCTC-3'；内参序列：上游引物5'-CCAACCGTGAAAAG ATGACC-3'，下游引物5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'；25μL反应体系，预变性94℃1m in，退火60℃1m in，延伸72℃2m in，循环35次。余按试剂盒说明进行操作，用反应产物的吸光度与内参的吸光度比值表示该基因表达强度。

1.8 统计学方法 采用SPSS统计学软件进行统计分析，计量资料采用t检验。

2 结果

2.1 各组Fas蛋白表达比较 见表1。正常组中Fas蛋白在细胞膜有表达，空白对照组出现较多棕黄色颗粒，与正常组比较，Fas表达明显升高（P＜0.01）；补中益气汤及顺铂作用后，Fas蛋白表达减少，与空白对照组比较，中药低剂量组、西药组Fas表达明显下降（P＜0.05），中药高剂量组下降最显著（P＜0.01）。中药高剂量组、中药低剂量组、西药组比较，Fas表达无明显变化（P＞0.05）。

2.2 各组Fas mRNA表达比较 见图1。与正常组比较，空白对照组Fas的m RNA的表达量明显增加（P＜0.01）；经补中益气汤及顺铂作用后，Fas m RNA的表达减少，中药高剂量组、中药低剂量组及西药组与空白对照组的差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），而该3组的Fasm RNA的表达与正常组无明显差异。

表1 各组Fas蛋白表达比较±s）

表1 各组Fas蛋白表达比较±s）

与正常组比较，①P＜0.05；与空白对照组比较，②P＜0.01，③P＜0.05

组别正常组空白对照组中药高剂量组中药低剂量组西药组n66666 Fas蛋白表达（平均光密度值）0.10±0.039 0.20±0.047①0.11±0.048②0.13±0.042③0.14±0.043③

图1 各组Fas m RNA表达比较

3 讨论

中医学理论认为，正气内虚，脏腑失调是肺癌发病的基础。由于正气不足，邪气趁虚而入，阻滞胸中，肺失宣降，气机不调，血瘀于络，且津液疏布不利，凝结成痰，痰瘀互结成块。至于晚期，患者均有不同程度的咳嗽咳痰，气短乏力，消瘦，面色无华等症状，中医辨证属肺脾气虚，病位在肺，治疗当“虚则补其母”，培土生金，健脾益气。目前，临床治疗多以放化疗为主，取得一定疗效的同时也会对机体的免疫功能造成损伤，因此提高机体的免疫能力也是治疗过程的关键。有研究证明，补中益气汤可以上调脾虚小鼠的免疫功能，主要表现为T淋巴细胞增殖能力有明显提高［4］。

Fas也称CD95，APo-1，为Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）受体和神经生长因子（NGF）受体超家族成员。在不同组织中表达不同，具有明显差异性。在机体内，Fas可以与其配体FasL结合，启动caspase的级联反应，最终使表达Fas的细胞内的结构和蛋白降解，并最终使其凋亡。而恶性肿瘤细胞可以通过上调Fas的配体FasL的表达，与肿瘤浸润淋巴细胞（Tum or Infiltrating Lymphocytes，CTL）表面的Fas结合进而导致CTL凋亡，该现象被认为是肿瘤细胞进行免疫反攻击从而逃避免疫监视的重要机制。研究发现，把高表达FasL的肿瘤细胞与人T细胞共同培养24 h后，发现T细胞的凋亡比例明显上升，证实了上述现象［5］。而使用FasL中和抗体，通过封闭肿瘤细胞表面的FasL，可以使免疫系统得到有效保护［6］。

基于上述，笔者对补中益气汤影响A549荷瘤小鼠脾组织的Fas表达进行了实验观察，结果发现，与正常组比较，对照组小鼠脾组织中的Fas表达明显升高，而高剂量补中益气汤可明显下调荷瘤小鼠脾组织的Fas表达；在基因检测方面，高剂量补中益气汤下调Fasm RNA的作用明显。该研究提示，补中益气汤有一定的抗肿瘤作用，该作用可能与下调T细胞Fas表达，减少其凋亡有关，可推广用于晚期肺癌的辅助用药。对于补中益气汤抗肿瘤、提高免疫功能的机制值得进一步进行研究。

［1］Le Deist F，Emile JF，Rienx-Lancat F，et al.Clinical，immunological and pathological consequences of Fas deficient conditions［J］.Lancet，1996，348：719.

［2］季宇彬.中药复方化学与药理［M］.北京：人民卫生出版社，2003：315-322.

［3］李瑞池.补中益气汤治疗晚期肺癌的体会［J］.现代中西医结合杂志，2006，15（3）：343-344.

［4］罗晶，顾红缨，徐国宪.补中益气汤对脾虚小鼠免疫功能的调节［J］.中国现代医学杂志，2006，16（17）：2613-2615.

［5］Zhang W，Ding EX，Wang Q，et al.Fas ligand expression in colon cancer：A possible mechanism of tum or immune privilege［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，11（23）：3632-3635.

［6］向青，徐波，徐梅.Fas/FasL途径介导的人肺癌细胞免疫逃逸［J］.中国病理生理杂志，2006，22（1）：168-171.

（责任编辑：骆欢欢）

Effect of Buzhong Yiqi Decoction on Fas Protein Expression in Splenic Tissue of A549 Tumor Bearing Mice

SUN Zhibin，JING Huan，LI Lulu，et al

Objective：To investigate the effect of Buzhong Yiqi Decoction on the protein expression of Fas in splenic tissue of A549 tum or bearing m ice.Methods：Lung cancer A549 mouse model was established for anti-lung cancer experiment.Thirty BALB/c mice were randomly divided into normal group，blank control group and high-dose Chinese medicine（CM）group，low-dose CM group，and western medicine group.Mice were given corresponding drug by intragastric administration for ten continuous days.Fas protein expression analyzed by immunohistochemistry（IHC），and Fas m RNA content was analyzed by reverse transcription polym erase chain reaction（RT-PCR）.Results：The protein and expression the content of m RNA of Fas were significantly increased in blank control group（P＜0.01 com pared with the normal group）.Com pared with the blank control group，the protein expression of Fas was decreased in low-dose CM group，CM high-dose group and western medicine group（P＜0.05，P＜0.01）.No statistical significant differences of Fas m RNA expression were found among the medication groups（P＞0.05）.Conclusion：Buzhong Yiqi Decoction can promote the immune system to attack the lung cancer cell by decreasing Fas protein expression in splenic tissue of A549 tumor bearing mice.

Buzhong Yiqi Decoction；Fas protein；A549 cell lines；Spleen

R285.5

A

0256-7415（2015）02-0227-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.106

2014-10-09

国家自然科学基金项目（81072743）；辽宁省教育厅项目（L2010355）

孙志彬（1981-），男，在读硕士研究生，研究方向：中药抗肿瘤。

井欢，E-mail：huanj99@163.com。