马钱子组分对人HaCaT细胞毒性作用的比较

陈海波，　马凤森，*，　方剑乔，　方 芳

（1.浙江工业大学药学院，浙江　杭州　310014；2.浙江中医药大学附属第三医院，浙江　杭州　310009）

马钱子组分对人HaCaT细胞毒性作用的比较

陈海波1，马凤森1，2*，方剑乔2，方 芳2

（1.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014；2.浙江中医药大学附属第三医院，浙江杭州310009）

目的 研究马钱子生物碱及其不同组分对人永生化表皮细胞系HaCaT细胞的毒性作用。方法 体外培养HaCaT细胞，加入相同质量浓度的马钱子碱、士的宁、马钱子碱与士的宁的混合物，和马钱子总生物碱作用于细胞24 h后，采用MTT比色法测定不同生物碱的细胞增殖抑制作用；流式细胞仪检测对HaCaT细胞的凋亡，比较马钱子生物碱不同组分对HaCaT细胞的毒性作用。结果 士的宁对HaCaT细胞的抑制率和细胞凋亡率大于马钱子碱；马钱子碱和士的宁混合物组对HaCaT细胞的抑制率和细胞凋亡率大于马钱子总生物碱。结论 马钱子生物碱组分均对HaCaT细胞存在细胞毒作用，呈剂量依赖关系，但马钱子碱的细胞毒性明显小于士的宁。

人永生化表皮细胞；细胞毒性；马钱子总生物碱；马钱子碱；士的宁

马钱子Strychni Semen为马钱子科植物马钱子Strychnos nux-vomica L.及云南长籽马钱Strychnos pierriana A.W.Hi11的干燥成熟种子，它的主要有效成分为马钱子生物碱，约占2%～5%，现已分离得到16个生物碱，其中最重要的为番木鳖碱（士的宁，strychnine）和马钱子碱（布鲁生，brucine），约占总生物碱的70%。马钱子生物碱具有抗炎、镇痛的功效，临床与实验治疗类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）效果显著［1-3］。

目前，马钱子治疗类风湿性关节炎的临床应用和实验性研究方面，主要有口服制剂和经皮给药制剂两类［4］。其中，经皮给药制剂可以降低直接口服毒性药物马钱子的中毒风险［5-6］。虽然有文献报道了动物实验研究马钱子制剂的皮肤刺激性，但是从细胞水平研究马钱子生物碱不同组分对皮肤的毒性作用，笔者尚未见国内文献报道。

本研究利用体外培养HaCaT细胞，观察马钱子总生物碱（tota1 strychnos a1ka1oids，TSD）及其不同组分对HaCaT细胞的毒性作用的影响，以进一步探索马钱子应用于抗类风湿性关节炎的更为合理的炮制、提取和马钱子经皮给药系统制备方法，为马钱子的安全、有效利用提供科学依据。

1　实验材料

1.1细胞 人永生化表皮细胞系，HaCaT细胞购自武汉细胞库。

1.2试剂与药品 马钱子碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号110706-200505，纯度95.9%）；士的宁对照品（中国食品药品检定研究院，批号110705-200306，纯度97%）；马钱子碱纯品（南京泽朗植提技术有限公司，批号ZL110116，纯度97.2%）；士的宁纯品（南京泽朗植提技术有限公司，批号ZL110120，纯度96.2%）；马钱子总生物碱（本实验室自制，批号20120828，含马钱子碱27.01%、士的宁26.95%、马钱子总生物碱67.38%）；胎牛血清（杭州天杭生物科技有限公司，批号130624）；MTT（sigama分装，批号M2128）；BU-ANNEXIN V-FITC凋亡试剂盒（Biouniquer Techno1ogy公司，批号BUAP0102）；PBS（吉诺生物医药技术有限公司，批号20130104）；0.25%Trypsin&0.02%EDTA（吉诺生物医药技术有限公司，批号13091701）；0.25%Trypsin（吉诺生物医药技术有限公司，批号20130722）；RPMT 1640培养液（吉诺生物医药技术有限公司，批号13080208）；DMSO（吉诺生物医药技术有限公司，批号130815）。

1.3主要仪器 倒置相差显微镜（Leica）；细胞培养箱（Thermo Forma 3111）；全波长酶标仪（MDS4）；流式细胞仪（Epics A1tra）；紫外-可见分光光度计（UV-1600PC）；液相检测器（LC-10AT）；电子天平（PT-1004/205）。

2　实验方法

2.1HaCaT细胞的培养 HaCaT细胞在37℃，5%CO2相对饱和湿度培养条件下，用含12%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）及链霉素（100 μg/mL）的RPMI1640培养液培养，待细胞生长至对数期，用于给药试验。

2.2主要试剂溶液的制备

2.2.1马钱子总生物碱 取马钱子总碱适量溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得含马钱子碱0.16 mg/mL、士的宁0.16 mg/mL，紫外分光光度法测定含马钱子总生物碱0.40 mg/mL。4℃冰箱保存，备用。

2.2.2马钱子碱溶液 取马钱子碱纯品溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得马钱子碱质量浓度为0.16 mg/mL，4℃冰箱保存，备用。

2.2.3士的宁溶液 取士的宁纯品溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得其质量浓度为0.16 mg/mL，4℃冰箱保存，备用。

2.2.4马钱子碱士的宁混合物溶液 取马钱子碱纯品、士的宁纯品溶解于细胞培养液中，过滤除菌，HPLC测得马钱子碱质量浓度为0.16 mg/mL，士的宁质量浓度为0.16 mg/mL，4℃冰箱保存，备用。

2.3重复性试验 精密吸取同一马钱子碱与士的宁的混合物含药培养液（含马钱子碱0.141 mg/mL，士的宁0.101 mg/mL）6份，每份0.5 mL，用流动相定容至5 mL，0.45μm微孔滤膜过滤，进样检测，计算得到马钱子碱和士的宁峰面积的RSD值分别为1.89%、1.60%。

2.4加样回收率测定 取马钱子碱士的宁混合物含药培养液1.0 mL（含马钱子碱0.063 mg/mL，士的宁0.062 mg/mL）6份，分别加入0.2 mL的马钱子碱、士的宁混合贮备液（含马钱子碱0.486 mg/mL，士的宁0.565mg/mL），混匀，流动相定容至10mL。HPLC测定含有量，计算回收率，结果见表1。测得马钱子碱、士的宁的平均回收率分别为103.3%、102.1%，RSD值分别为1.25%、1.27%。2.5 稳定性试验 精密吸取同一马钱子碱与士的宁的混合物含药培养液（含马钱子碱0.141 mg/mL，士的宁0.101 mg/mL）分为4组，6份/组。于0 h时检测组1的马钱子碱、士的宁；24 h时检测组2（4℃）的马钱子碱、士的宁，组3（室温）的马钱子碱、士的宁；48 h时检测组4（4℃）的马钱子碱、士的宁。每份取0.5 mL，用流动相定容至5 mL，0.45μm微孔滤膜过滤，进样，测定。结果见表2。

表1　马钱子碱、士的宁加样回收率（n=6）Tab.1 Resu Its of recovery tests for brucine and strychnine（n=6）

表2　培养液中马钱子碱、士的宁的稳定性（n=6）Tab.2 StabiIity test of brucine，strychnine in m edium（n=6）

结果显示在室温和4℃下存放24 h，马钱子碱、士的宁含有量基本无变化；在4℃下存放48 h，马钱子碱、士的宁含有量稳定、无明显变化。

2.6MTT法检测药物对HaCaT细胞增殖的影响取对数期的HaCaT细胞，用含体积分数0.25%胰酶和0.01%EDTA-Na的消化液消化，1640培养液洗涤离心（1 500 r/min，6 min），调整细胞密度为1×108个/L，接种于96孔细胞培养板，每孔中加入100μL细胞悬液，培养12 h使细胞贴壁后，分别加入200μL 4个不同质量浓度的马钱子总生物碱、马钱子碱与士的宁的混合物、士的宁、马钱子碱（见表3）。每个样品设5复孔。以含细胞不加药物的1640培养液作为标准对照，以不含细胞的1640培养液作为空白对照。给药培养24 h后，每孔加入含0.5 mg/mL MTT的工作液200μL；培养4 h后，除去MTT的工作液，再每孔加DMSO 100 μL，摇床摇匀，室温、避光孵育10 min，在波长570 nm处用酶标仪测吸光度值。计算细胞相对抑制率，相对抑制率计算公式如下：相对抑制率R%=［1-（样品孔吸光度/标准对照孔吸光度）］×100%。

表3　增殖试验中不同给药质量浓度（mg/m L）Tab.3 Different drug concentrations in ceIIproIiferation（mg/m L）

2.7流式细胞术检测药物对HaCaT细胞凋亡的影响 根据上述增殖抑制结果，细胞凋亡试验选用药物分别为马钱子碱溶液（含马钱子碱0.098 mg/mL）、士的宁溶液（含士的宁0.104 mg/mL）、马钱子总生物碱溶液（含马钱子碱0.096 mg/mL、士的宁0.101 mg/mL）、马钱子碱与士的宁混合物溶液（含马钱子碱0.103 mg/mL、士的宁0.103 mg/mL）。取对数期细胞接种至培养瓶中，培养24 h后，分别加上述含药培养液培养24 h，设对照组（只加细胞不加药物），收集细胞，调整密度为5× 105个/mL，取0.5 mL结合缓冲液（binding buffer）悬浮细胞，加入5μL Annexin V-FITC，5μL碘化吡啶（Propidium Iodide），混匀，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪进行检测。以上每组重复3次。

3　结果

3.1马钱子生物碱不同组分对细胞形态的影响

在显微镜下观察空白对照组的HaCaT细胞为多边形且聚集生长（如图1所示）。马钱子碱、士的宁处理24 h后，观察到细胞数量略有减少，仅有部分细胞的细胞质皱缩，核致密，体积变小等改变（如图2、图3所示）。马钱子碱与士的宁的混合物、马钱子总生物碱处理24 h后，观察到细胞数量明显减少，且大部分细胞发生细胞质皱缩，核致密，体积变小等改变（如图4、图5所示）。结果表明马钱子碱、士的宁和马钱子总生物碱均对细胞有一定的毒性，马钱子碱对HaCaT细胞的毒性较士的宁对HaCaT细胞的毒性小，马钱子总生物碱对HaCaT细胞的毒性较马钱子碱与士的宁的混合物对HaCaT细胞的毒性小。

图1　空白对照组细胞Fig.1　HaCaT ceIIof non-treated controIs

图2　马钱子碱处理后细胞Fig.2　HaCaT ceII treated w ith brucine

图3　士的宁处理后细胞Fig.3　HaCaT ceIItreated w ith strychnine

图4　马钱子碱与士的宁的混合物处理后细胞Fig.4　HaCaT ceII treated w ith the m ixture of brucine and strychnine

图5　马钱子总生物碱处理后细胞Fig.5　HaCaT ceII treated w ith TSD

3.2马钱子生物碱不同组分对细胞增殖的影响

分别加入不同质量浓度的马钱子碱、士的宁、马钱子碱与士的宁的混合物和马钱子总生物碱，作用于HaCaT细胞24 h后，采用MTT比色法检测药物对HaCaT细胞增殖抑制作用，并计算其抑制率（见表4），间接的表明药物对细胞的毒性。

同质量浓度样品组中，与马钱子碱组比较，士的宁组在质量浓度1～4组时对细胞的抑制作用均明显大于马钱子碱（P＜0.01）；而在低质量浓度样品5组时，士的宁的抑制作用较马钱子碱低（P＜0.05），如表4。

同质量浓度组中，与马钱子总生物碱组比较，马钱子碱与士的宁的混合物组在各质量浓度时对HaCaT细胞的抑制作用均明显大于马钱子总生物碱（P＜0.01），如表4。

3.3马钱子生物碱对HaCaT细胞凋亡的影响 马钱子碱、士的宁、马钱子碱士的宁的混合物和马钱子总生物碱，分别作用于HaCaT细胞24 h后，流式细胞术测定不同药物对HaCaT细胞凋亡作用的结果见表5。

表4　马钱子生物碱不同组分对HaCaT细胞增殖的抑制（±s，n=5）Tab.4 Effect of different components of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIproIiferation（±s，n=5）

表4　马钱子生物碱不同组分对HaCaT细胞增殖的抑制（±s，n=5）Tab.4 Effect of different components of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIproIiferation（±s，n=5）

注：与同质量浓度组的马钱子碱组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与同质量浓度组马钱子碱士的宁组混合物比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别编号马钱子碱/%士的宁/%马钱子碱与士的宁的混合物/%马钱子总生物碱/% 1 16.11±5.07 55.86±6.16**76.53±3.25 67.47±2.96△2 12.79±5.28 27.34±3.72**53.64±6.20 12.68±5.75△△3 11.34±3.69 26.89±4.76**31.68±5.10 8.80±5.41△△4 8.98±3.83 23.44±3.99**26.73±8.25 8.83±4.60△△5 8.50±2.95 3.58±0.74*11.75±3.99 1.65±0.06△△

表5　马钱子生物碱不同组分对HaCaT细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.5 Effect of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIapoptosis（±s，n=3）

表5　马钱子生物碱不同组分对HaCaT细胞凋亡的影响（±s，n=3）Tab.5 Effect of strychnos aIkaIoids on HaCaT ceIIapoptosis（±s，n=3）

注：与马钱子总生物碱比较，△△P＜0.01

组别早期凋亡率/% 5.63±1.33士的宁组7.05±2.29马钱子总生物碱组5.10±0.44马钱子碱士的宁混合物组23.0±2.08马钱子碱组△△

4　讨论

类风湿性关节炎是一种以慢性进行性关节滑膜病变为特征的全身性自身免疫性疾病。其中大量的临床研究和实验研究均证明［7-8］，马钱子在治疗类风湿性关节炎方面具有显著效果，其中主要有效成分及有毒成分为马钱子碱和士的宁等生物碱类物质。

马钱子的毒性研究大多采用动物实验进行［9-10］，该方法的周期相对较长，药品用量大等不足。而细胞实验可以快速、准确、高效的筛选药物和检测药物的毒性，如抗肿瘤药物的筛选。赵春玲等［11］采用染色法快速测定了白眉蝮蛇去整合素（rAdinbitor）对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞黏附性的影响。李运曼等［12］以DNA拓扑异构酶Ⅱ为研究靶点，研究紫草素对人白血病K562细胞的增殖抑制的影响。K1ein等［13］以微管蛋白为靶点，研究紫杉醇和discodermo1ide（从海绵动物中分离得到的多羟基内酯化合物）对A549肺癌细胞的作用，结果显示两物质均能迅速导致其细胞有丝分裂的异常。Omari等［14］以HepG2/C3A细胞快速准确的证明了一系列化学混合物的毒性，为后续实验研究提供基础。

本课题组已进行的研究表明马钱子生物碱对类风湿性关节炎的治疗具有明显疗效，并且在一定质量浓度范围内马钱子碱对类风湿性关节炎滑膜细胞的增殖抑制作用强于士的宁［15］。本实验选用人永生化表皮细胞作为模型细胞，考察马钱子生物碱对皮肤细胞的毒性作用。实验结果显示：马钱子生物碱对HaCaT细胞的毒性呈剂量依赖性，随着剂量的降低效果不断减弱。在质量浓度为0.16 mg/mL、0.08 mg/mL、0.04 mg/mL和0.02 mg/mL时，士的宁对HaCaT细胞的毒性约为马钱子碱的2.5倍；在各剂量组下，马钱子总生物碱对HaCaT细胞的毒性均明显低于马钱子碱与士的宁的混合物。凋亡实验显示士的宁的作用强于马钱子碱，且马钱子总生物碱明显低于马钱子碱与士的宁的混合物，这也对进一步验证了马钱子生物碱各组分对HaCaT细胞的毒性，其结果与增殖抑制实验一致。

本实验发现马钱子碱对HaCaT细胞的毒性低于同质量浓度组士的宁的毒性，TSD对HaCaT细胞的毒性低于同质量浓度组马钱子碱与士的宁的混合物组的毒性。这提示在经皮给药治疗类风湿性关节炎方面，马钱子碱比士的宁具有更明显的优势；总生物碱中其他组分可以明显降低士的宁对HaCaT细胞的毒性，其具体机理尚不明确，值得进一步的实验验证。

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［15］方 芳，陈海波，马凤森，等.马钱子生物碱组分对类风湿性关节炎滑膜细胞增殖作用的比较研究［J］.浙江中医药大学学报，2013，37（1）：1-4.

Cytotoxicity of com ponents from seeds of Strychnos nux-vom ica to human HaCaT keratinocytes

CHEN Hai-bo1， MA Feng-sen1，2*， FANG Jian-qiao2， FANG Fang2
（1.College of Pharmaceutics，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；2.The Third Clinical Hospital of Zhejiang ChineseMedical University，Hangzhou 310009，China）

AIM To study the cytotoxicity of a1ka1oids from Strychni Semen and its different components on HaCaT ce11，an immorta1ized human epiderma1 ce111ine.METHODS After in vitro HaCaT ce11s being cu1tured co-cu1tured with same concentrations of brucine，strychnine，and themixture of brucine and strychnine，tota1a1ka-1oids from Strychni Semen for 24 h，the number of viab1e ce11swas observed using the MTTmethod.The ce11apoptotic rate was detected and ca1cu1ated by f1ow cytometry.Cytotoxicity on HaCaT ce11was compared among a1ka1oids from Strychni Semen.RESULTS The pro1iferation rates and the apoptotic rate of strychnine on HaCaTwere greater than brucine at the same concentration，themixture of brucine and strychnine on HaCaTwere greater than tota1 a1ka1oids from Strychni Semen simi1ar1y in those two rates.CONCLUSIN The components of a1ka1oids from Strychni Semen have obvious cytotoxicity to HaCaT ce11in a dose-dependent re1ationship，meanwhi1e，cytotoxicity of brucine is 1ower than that of strychnine.

HaCaT ce11；cytotoxicity；tota1a1ka1oids from Strychni Semen；brucine；strychnine

R966

A

1001-1528（2015）01-0016-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.004

2014-01-19

浙江省重大科技专项重点社会发展项目（2010C13014），浙江省自然科学基金项目（Y2111194）

陈海波（1988—），男，硕士，研究方向：天然药物及其制剂。E-mai1：haibochen1988@126.com

马凤森，男，教授，研究方向：药物新剂型与新技术研究。Te1：（0571）88871500，E-mai1：merrigen@126.com

日期：2014-05-09

http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.R.20140509.1117.001.htm1