青蛤（Cyclina sinensis）亲环素A基因的克隆与鳗弧菌刺激后的表达分析

张海静，魏 星，潘宝平

（天津师范大学a.生命科学学院，b.天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

青蛤（Cyclina sinensis）是我国沿海常见的经济贝类.由于其具有生长迅速、肉质鲜嫩、营养价值高和对环境有很强的适应性等产业化增养殖特点，目前我国对于青蛤的增养殖区域相当广泛[1]，随之而来有关青蛤大规模病害和死亡现象的报道也日益增多.因此为推动国内青蛤养殖产业的可持续健康发展，开展对青蛤免疫抗病害机制方面的研究显得尤为重要.

亲环素（Cyplophilin）是一个多功能蛋白家族，也是一种普遍分布的胞内蛋白，具有肽基脯氨基顺反异构酶（PPIase）活性[2]，能够加速自身折叠、体内新生肽链折叠及变性蛋白质的体外折叠，起到分子伴侣的作用[3].亲环素A具有多种生物学活性，可参与信号传导、调节细胞凋亡等.在细菌、真菌、植物和哺乳动物中分布广泛，同时在生物进化过程中具有很高的保守性[4].据相关文献报道，至少在六亿年以前就存在亲环素，在长期的演变和进化过程中，它始终存在于各种生物的细胞内，担当着管家基因（Housekeeping genes）产物的角色[5].亲环素A（Cyplophilin A，CypA）是亲环素家族内存在最广泛、保守性最强的一类，是环孢素A的细胞内受体，介导环孢素A发挥免疫抑制作用[6].它在细胞和体液中的含量直接影响环孢素A的药效发挥.亲环素A最早被发现存在于牛胸腺细胞中，并被提取出来[7]，之后从多种动植物的细胞中也提取出该种蛋白，并克隆出了异构体，这些异构体构成了亲环素A的蛋白家族[8].按照蛋白来源，可将亲环素A家族大致分为线虫类、眼虫类、真菌类、扁形类、植物类和哺乳动物类6大类，其中研究最详尽的是人体和拟南芥中的亲环素[9]，对于软体动物中亲环素的报道相对较少.

本研究从分子免疫学角度出发，对筛选出的青蛤亲环素A基因（CypA）进行一系列的基因及蛋白序列分析，通过实时定量PCR的方法研究青蛤体内不同组织之间亲环素A基因表达量的差异，观测低浓度致病菌鳗弧菌侵染后不同时间内青蛤血淋巴中亲环素A表达量的变化，探讨亲环素A参与青蛤的固有免疫机制，为选育抗病能力较强的青蛤品系提供实验数据.

1 实验材料与方法

1.1 材料

活体青蛤样品采于天津大港滩涂，选取形态指标无显著差异的个体，实验之前将青蛤放置在通气的人工海水中暂养1～2周.持续曝气，每24h换水1次，每天投喂0.005 g/mL的小球藻.

鳗弧菌为天津师范大学生命科学学院动物学实验室冻存菌种，实验之前将其以1∶100比例接种至2216E液体培养基中，放置于28℃摇床中200 r/min培养1 d.用随机分组的方法，设10个平行组.实验组青蛤每只注射50μL鳗弧菌菌液，对照组青蛤每只注射等量灭菌生理盐水.处理后用5 mL的注射器分别于 3、6、12、24、36、48h 时从闭壳肌取血.

1.2 方法

1.2.1 cDNA文库的构建

将青蛤各组织放于液氮中研磨后，置于1 mL的trizol中提取组织总RNA，mRNA的分离按QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits试剂盒操作手册进行.根据Clontech公司的SMART-cDNA Library Construction Kit试剂盒说明书进行cDNA文库的构建，连接载体使用pBluescriptⅡSK+改造体，转化菌株为 E.coli（DH5α）.文库随机测序引物：T7-F（5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′），T3-R （5′-AATTAACCCTCACTAAAGG-3′）.所得序列去除载体序列后拼接得到contig和无法与其他序列拼接的singlest数据，将测得的序列用Blast进行同源性分析.

1.2.2 鳗弧菌刺激后青蛤CypA基因在血淋巴内的时序性表达

用鳗弧菌刺激青蛤后，测定青蛤CypA基因在血淋巴内的时序性表达.参照1.2.1中的方法，分别提取鳗弧菌刺激下各时间点的血淋巴总RNA，反转成cDNA.以β-actin为内参基因，实时定量引物为：βactin-F（5′-CACCACAACTGCCGAGAG-3′）；β-actin-R（5′-CCGATAGTGATGACCTGACC-3′）；CPL-F（5′-GTCACATTCGCCAAGCAA-3′）；CPL-R（5′-TGAAGGACCAGCAAGAGCC-3′）.反应在iQ5荧光定量PCR仪上进行，操作按照TAKARA公司的SYBRPremix DimerEraserTM（Perfect Real Time）使用说明进行.反应程序为：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，58℃退火30 s，最后72℃延伸30 s，40个循环.数据处理采用2-ΔΔCT法，使用SPSS软件对同一时间点的实验组与对照组、实验组和空白组的表达水平进行单因素方差分析.

1.2.3 青蛤CypA基因的原核表达

用特异性引物CypA-F（5′-GGATCCATGGCTAACCCAAAGTGTTATTTTG-3′）和 CypA-R（5′TTCGAATTAAAGCTGACCACAATCTTGAATG-3′）扩增得到青蛤CypA成熟肽基因，连接到pMD18-T载体中得到pMD18-T-CypA，并用 pMD18-T载体通用引物和青蛤CypA特异性引物进行阳性克隆筛选，测序鉴定.用NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD18-T-CypA，用试剂盒回收青蛤CypA基因并将其与NdeⅠ和EcoRⅠ酶切开环的pET30（+）连接，转入表达宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，得到重组质粒pET30（+）-CypA.用T7引物和CsCypA特异性引物进行阳性克隆筛选及测序鉴定.

1.2.4 重组蛋白的纯化与复性

将转化菌株接入到LB液体培养基中（含100 g/mL的硫酸卡那霉素），37℃、220 r/min培养至 OD值为600左右，取1 mL作为诱导前的对照，把IPTG（终质量浓度1 mg/mL）加入到剩余的菌液中，37℃下诱导培养，每隔1h取样1次，每次取1 mL.取500 mL诱导的菌液，4℃、6 000 r/min离心，收集菌体，以菌体裂解液重悬并超声破碎.4℃、6 000 r/min再次离心，将沉淀重悬并过滤膜后得到重组蛋白粗提液.

重组蛋白粗提液使用康为世纪公司的Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）进行纯化，将收集到的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测.采用透析法进行复性，将纯化后的蛋白放在透析袋中，内含50 mmol/L 的 Tris-HCl和 6、4、3、2、1、0 mol/L 的尿素缓冲液（pH 5.5）.将复性后的蛋白冻干并称重，置于－80℃超低温冰箱中保存备用.

2 结果

2.1 青蛤CypA基因的结构分析

构建的容量为1.12×106cfu/mL的SMART-cDNA文库，其重组率约为96.4%.经随机挑取克隆进行大规模测序后，使用Blastx在线对其比对分析，结果发现了CypA家族基因的类似序列，并将此序列命名为青蛤CypA，在Gen Bank的注册号为JN806098.

青蛤亲环素A基因cDNA的核苷酸及对应的氨基酸序列如图1所示.

图1 青蛤CypA全长cDNA序列的开放阅读框及功能域Fig.1 Open reading frame and functional domain of cDNA sequence of C.sinensis CypA

该 cDNA 序列全长为 962 bp，5′UTR 为 87 bp，3′UTR为346 bp，开放阅读框长度为495 bp，可以编码164个氨基酸.使用SMART在线分析软件对青蛤亲环素A进行蛋白质序列分析，发现无信号肽结构，由此证明亲环素A属胞内蛋白，含有1个完整的Pro_isomeraes结构域，为亲环素A的典型结构域.使用Prot-Param工具分析青蛤亲环素A的理论相对分子质量、等电点和氨基酸组成，其理论相对分子质量为19.39 kDa（1 kDa=1 000摩尔质量），理论等电点为5.25.成熟肽包含164个氨基酸，分子式为C1500H2507N495O637S85，氨基酸组成中丙氨酸（Ala）含量最大，占28.9%.使用Swiss-model和Swiss-PdbViewer在线分析软件对获得的青蛤亲环素A的空间结构进行预测和查看，结果显示亲环素A主要具有 α-螺旋（α-helix）、β 折叠（βsheet）和无规则卷曲等二级结构，整体结构比较紧凑.

2.2 鳗弧菌刺激后青蛤CypA基因在血淋巴内的时序性变化

青蛤被鳗弧菌侵染后，以β-actin为内参基因，利用实时荧光定量PCR分析青蛤CypA基因在血淋巴中表达量的时序变化，结果如图2所示.

图2 青蛤血细胞CypA基因在鳗弧菌刺激不同时间表达量的变化Fig.2 Relativeexpression of CypA gene in blood of C.sinensis infected by Vibrio anguillarum at different time

由图2可以看出，实验组在感染后3h时表达量开始升高并且达到最大值，与对照组的差异具有高度统计学意义（p＜0.01），6h后表达量大幅下降，96h时基因表达量恢复到正常水平.而对照组除了在6h时有略微升高之外，其余的时间点无明显变化.

2.3 青蛤CypA基因的原核表达结果

对青蛤CypA成熟肽基因进行PCR扩增，得到产物长度约为500 bp的DNA片段，与预期大小基本一致.pET-30和PMD18T-CypA经双酶切后，将所得目的片段和线性表达质粒经琼脂糖凝胶电泳检测后用试剂盒切胶回收，其目的片段大小为500 bp，与预期符合.具体结果如图3所示.将所得CsCypA目的片段和pET-30线性质粒进行连接，转化培养后，对其进行阳性单克隆PCR检测并送测序，所得测序结果经比对正确，重组表达载体构建成功.

图3 琼脂糖凝胶电泳显示的重组序列的PCR产物Fig.3 PCR products of recombination sequenceof CsCypA showed by AGE

2.4 重组蛋白的纯化与复性结果

将构建的重组i型溶菌酶基因工程菌（pcr-pET-30-CypA）提取质粒，转到大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中，扩大培养后加入IPTG进行诱导表达，利用镍离子交换柱分离并纯化出重组蛋白.经SDS-PAGE检测显示，IPTG诱导后的菌体与诱导前对照样品相比，该工程菌株诱导后的样品在约19 kDa处产生了1条明显的特异性电泳带，并纯化出了相应大小的重组蛋白，如图4所示，其相对分子质量和理论计算值基本吻合.

图4 融合蛋白的纯化Fig.4 Purification of fusion protein

3 讨论与结论

本研究从已构建的青蛤ESTs库中筛选得到亲环素A基因cDNA的全长序列，对该序列进行分析，发现亲环素A含有一个完整的Pro_isomeraes结构域，为亲环素A的典型结构域.在已知的栉孔扇贝的CypA基因中同样存在一个完整的Pro_isomeraes结构域[10]，它能够加速自身折叠、体内新生肽链折叠及变性蛋白质的体外折叠，具有分子伴侣的作用.

鳗弧菌是海洋动物中最常见的一种致病微生物，贝类被其侵染后会出现出血性败血症，进而导致其局部组织损伤乃至死亡[11].相关研究显示[12]，低浓度的鳗弧菌对青蛤进行刺激后，与免疫相关的因子如热休克蛋白、磷酸酶、抗菌肽、溶菌酶等基因在一定时间内均发生了上调表达，且其血清中的各种免疫相关酶蛋白的含量也随之升高.本研究利用荧光定量PCR方法分析了青蛤血淋巴CypA基因在鳗弧菌刺激后的表达情况，结果发现，实验组青蛤CypA基因的表达量在鳗弧菌刺激后3h开始呈上升趋势并达到最大值，与对照组的差异具有高度统计学意义（p＜0.01），96h时表达量基本恢复到正常水平.这表明青蛤血淋巴中的CypA在鳗弧菌刺激下能够大量表达，暗示其可能在血淋巴中具有防御细菌感染的特殊作用.例如在斑点叉尾鮰的卵细胞系中，CypA基因受到爱德华氏菌（Edwardsiella Ictaluri）感染后表达量上调，证明其在爱德华氏菌感染的早期阶段有重要作用[13].近年来在斑节对虾（Penaeus Monodon）中也发现了亲环素A基因，受到LPS刺激后在肝胰腺中表达量上调[14].由此推测CypA基因参与了青蛤的先天性免疫反应，尤其是在抵抗不良环境因子的过程中发挥了重要作用.

本研究以pET-30α作为表达载体系统，构建出了pET30α（+）-CypA重组质粒，并通过T7启动子和1个6×His标签来控制表达的严谨性.研究最终得到了相对分子质量在19 kDa左右的目的蛋白，其结果与预测的CsCypA相对分子质量理论值19.39 kDa相当吻合.本研究结果为进一步揭示青蛤的免疫防御体系，选育抗病抗逆的青蛤优质品种奠定了一定的实验基础.

[1]宋欣，张丽岩，高玮玮，等.鳗弧菌侵染对青蛤（Cyclina sinensis）磷酸酶活性的影响[J].海洋与湖沼，2010，41（2）：254-258.

[2]HAENDLERB，HOFFERE.Characterization of thehuman cyclophilin gene and of related processed pseudogenes[J].Eur JBiochem，1990，190（3）：477-482.

[3]FRESKGARD P，IRVING B，CRABTREE G，et al.Isomerase and chaperone activity of prolylisomerase in the folding of carbonic anhydrase[J].Science，1992，258（5081）：466-468.

[4]么宗利，王慧，周凯，等，我国5个青蛤地理群体形态差异分析[J].海洋水产研究，2007，28（2）：63-70.

[5]GALATA.Peptidyl proline cis-trans isomerase：immunophilins[J].Eur JBiochem，1993，216（3）：689-707.

[6]白宇杰，马华升，王火旭，等.植物细胞亲环素研究进展[J].植物生理学通讯，2010，46（9）：881-888.

[7]潘克厚，马晓磊，石娟.亲环素的研究进展与展望[J].中国海洋大学学报：自然科学版，2008，38（3）：371-376.

[8]HANDSCHUMACHER R E，HARDING MW，RICE J，et al.Cyclophilin：a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A[J].Science，1984，226（4674）：544-547.

[9]RIFFLE B，WORLEY G，GREINER B，et al.Distribution of the cyclosporine binding protein cyclophilin in human tissues[J].Immunology，1991，72（3）：399-404.

[10]SONGX，WANGL，SONGL，etal.A cyclophilin A inducible expressed in gonad of zhikong scallop Chlamys farreri[J].Mol Biol Rep，2009，36（6）：1637-1645.

[11]JAYASREE L，JANAKIRAM P，MADHAVIR，et al.Characterization of Vibrio spp.associated with diseased shrimp from culture ponds of Andhra Pradesh （India）[J].Journal of the World Aquaculture Society，2006，37（4）：523-532.

[12]CHENGTC，GUIDAVG，GERHARTPL.Aminopeptidaseand lysozyme activity levelsand serum protein concentrationsin Biomphalariaglabrata（Moliusca）challengedwithbacteria[J].Journalof Invertebrate Pathology，1978，32（3）：297-302.

[13]YEHh Y ，KLESIUS Ph.Channel catfish，Ictalurus punctatus，Cyclophilin A and B cDNA characterization and expression analysis[J].Vet Immunol Immunopathol，2008，121（3/4）：370-377.

[14]QIU L，JIANG S，HUANG J，et al.Molecular cloning and mRNA expression of cyclophilin A gene in black tiger shrimp（Penaeus monodon）[J].Fish Shellfish Immunol，2009，26（1）：115-121.