圈养麋鹿疱疹病毒感染的诊断

张成林 ，王铜铜 ，郑常明 ，罗 毅 ，吴秀山 ，刘 燕 ，贾 婷 ，李 莹 ，杨明海 ，佘锐萍 ，张金国

（1.北京动物园，北京100044；2.圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京100044；3.中国农业大学动物医学院，北京100094）

麋鹿（Elaphurus davidianus），又称四不像，隶属偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）麋鹿属（Elaphurus），是中国特有物种，为国家一级重点保护野生动物，同时也被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅰ名录中，为野外绝灭物种[1].目前在全球23个国家和地区约200个公园或保护区中有麋鹿饲养，总数量约3 000只[2].我国先后建立北京南海子、江苏省大丰和湖北省石首3个国家级麋鹿保护区，在许多动物园中也有麋鹿饲养[3].关于麋鹿疾病的相关研究一直以来都备受关注，有关麋鹿疾病研究的报道有恶性卡他热[4]、黏膜病[5-6]、血吸虫病[7]、长角血蜱病[8]、魏氏梭菌病[9]、巴氏杆菌病[9]、产气荚膜梭菌病[10]、炭疽病[11]、放线菌病[12]等.2012年北京动物园3只麋鹿死亡，怀疑为疱疹病毒感染所致.国外对疱疹病毒感染的研究报道较多，尤其是不同种动物间的传播，如在动物园饲养环境中的角马可以将疱疹病毒传播给鹿及多种羚羊[13]，绵羊携带的绵羊疱疹病毒Ⅱ型能传播给与其接触的牛[14]，山羊也是该病毒的传播者[15].

目前国内还没有关于麋鹿感染疱疹病毒的资料.本课题组从死亡麋鹿的病理变化和病原检测方面进行研究，查找引起此次麋鹿发病死亡的病因，为圈养麋鹿的疾病防控积累资料.

1 动物临床资料

1.1 临床表现

北京动物园曾在同一圈舍内饲养5只麋鹿，1只雄性，4只雌性，均成年.在2012年12月份，先后有3只雌性麋鹿发病，其中2只患病麋鹿出现相同症状，口腔分泌物增多，眼结膜红，食欲废绝，活动减少，不愿活动，呼吸粗、频率快，2～3 d后死亡.第3只雌性个体发生流产，胎儿发育正常，胎儿脏器有出血，母兽没有其他症状，但日渐消瘦，半年后死亡.

1.2 病理变化

2只急性期死亡麋鹿的临床症状和病变相似.

外观：死亡麋鹿营养状况一般，腹部隆起，口腔周围有泡沫样液体，口腔黏膜呈深红色，阴道黏膜潮红，舌肌表面有大量出血点.

主要病理变化：体表淋巴结肿大出血，呈暗红色，切面外翻、湿润、呈深红色，尤其是颌下淋巴结和咽淋巴结较为明显.喉头处黏膜出血，可见少量红色污浊液体.食管黏膜面粗糙，出血，呈暗红色.瘤胃膨大，左侧浆膜面粗糙，黏膜面可见散在出血点，瓣胃和皱胃黏膜面出血，呈暗红色，在网胃和瓣胃交界处也可见鲜红色出血点.小肠段出血，肠壁菲薄，食糜呈黑色.肝脏肿大，边缘钝圆，被膜面颜色不均匀，土黄色和灰绿色相间，肝脏切面呈土黄色，有鲜红色斑块.脾脏质地柔软，切面结构模糊，呈黑色.肾脏肿大，被膜面有散在出血点，切面呈暗红色，皮髓质分界明显，髓放线明显.膀胱黏膜弥散性分布大量米粒大小出血块.子宫膨大，内有一胎儿，胎儿脑膜血管怒张、充血，颈部散在多个出血点，胎盘充血、出血，子宫淋巴结切面肿胀、出血、湿润.肺脏显著肿大，呈红色，肺小叶轮廓清楚，切面湿润，有多处局灶样红色斑块，取1块肺脏放入水中呈漂浮状.气管及支气管腔内充满白色泡沫样液体，黏膜呈暗红色，血管明显.心包内有红色心包积液，心肌扩张明显，质地柔软粗糙，心外膜可见红色出血点，弥散性分布有白色条纹，左心室有凝血块.

2 材料和方法

2.1 组织材料及保存

在病理剖检过程中，留存需要进一步检查用的材料.

2.1.1 细菌检查用材料

进行病变组织的平板划线，用于细菌培养.

胸腹水的采集：打开胸腹腔后立即使用无菌注射器和针头吸取，置于无菌玻璃瓶中冷藏，标注动物的名称、编号、取样时间等.

2.1.2 病理学检查用组织

根据组织的病理变化，选取病变明显部位，取体积大小约1 cm×2 cm×2 cm的组织，放入装有多聚甲醛-戊二醛（体积分数分别为2.5%和2.0%）的混合固定液中保存.标注动物的名称、编号、取样时间等.

不同位置的淋巴结等极易混淆的组织，分别存放并做好标记.

2.1.3 分子病原学检查用材料

将分子病原学检查用的脑、肝、脾、肾各取1块新鲜组织，置于无菌密封采样袋中，标注动物的名称、编号、取样时间，及时放到-80℃冰箱内冷冻保存.

2.2 细菌检验

2.2.1 主要试剂

普通营养琼脂培养基、麦康凯平板、血平板，北京朋利驰科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；PCRmix、DNAMaker DL2000等，北京全式金生物技术有限公司.

2.2.2 主要仪器设备

全自动凝胶成像分析系统ChampGel5000，北京赛智创业科技有限公司；PCR仪，朗基科学仪器有限公司.

2.2.3 细菌分离培养和鉴定

分离和培养：在剖检过程中无菌采集病死麋鹿的肝脏、脾脏、肾脏、口腔病变样品，分别划线接种于营养琼脂培养基、麦康凯培养基和血平板培养基，37℃恒温培养箱培养24～48h，仅口腔病变样品长出菌落.挑取优势菌的单个菌落，接种新培养基，再纯化培养24～48h.

细菌16s RNA的提取及扩增：挑取纯培养的单个菌落，用细菌基因组提取试剂盒提取细菌的基因组DNA，以16s RNA的通用引物进行PCR扩增.正向引物为 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物为 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[16].PCR 反应体系为：PCRmix 10μL，正向引物 1μL，反向引物 1μL，DNA 模板 1μL，双蒸水 37μL，整个体系50μL.扩增产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成.

2.3 病毒检验

2.3.1 PCR检测

主要试剂：组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒、Goldview核酸染料，北京艾德莱生物科技有限公司；PCR mix、DNA Maker DL2000，北京全式金生物技术有限公司.

引物设计与合成：选用Li等[17]设计的疱疹病毒聚合酶基因引物，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.具体包括：DFA（5′-GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC-3′），ILK（5′-TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNAA-3′），TGV（5′-TGTAACTCGGTGTAYGGNTTYACNGGNGT-3′），IYG（5′-CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT-3′），KG1（5′-GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT-3′）.

提取DNA：根据试剂盒标注的操作步骤要求，提取疱疹病毒的DNA.

PCR扩增：经过2轮PCR完成.第1轮PCR使用上游引物DFA、ILK和下游引物KG1，反应体系为：PCRmix10μL，上游引物DFA 1μL，上游引物ILK 1μL，下游引物KG1 1μL，DNA模板4μL，双蒸水8μL，整个体系25μL；第2轮PCR使用上游引物TGV和下游引物IYG，反应体系为：PCRmix 10μL，上游引物TGV 0.5μL，下游引物 IYG 0.5μL，DNA 模板 4μL，双蒸水10μL，整个体系25μL.PCR反应条件为：94℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，46℃退火 1 min，72℃延伸1 min，45个循环.72℃最终延伸7 min.

最后目的产物大小约为238 bp.扩增产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成.

2.3.2 免疫组织化学染色观察

主要试剂：通用型SP（Streptavidin-Peroxidase）检测试剂盒、DAB显色试剂盒、进口羊血清工作液ZLI9022，中杉金桥生物技术有限公司.

疱疹病毒UL16蛋白：由美国马里兰大学朱小平教授提供.

疱疹病毒多克隆抗体的制备：取28日龄的SPF昆明小鼠数只，以疱疹病毒UL16蛋白腹腔注射，免疫3次后，采集血液，分离血清，即为疱疹病毒抗血清，为一抗用多克隆抗体.

免疫反应：将组织进行常规石蜡切片制片，采用制备的疱疹病毒抗血清，利用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法对组织切片进行免疫组织化学染色，然后进行镜检.

使用Olympus BX51-TRF生物摄影显微镜镜检.

2.3.3 电镜观察

使用JEM-1230型透射电子显微镜对肝脏、脾脏、肾脏等病变组织进行电镜观察.

3 结果

3.1 细菌检测

3.1.1 分离培养

口腔病变组织培养后长出圆形光滑的大菌落，呈短杆状，革兰氏阴性，其他病变组织中没有分离到细菌.

3.1.2 细菌的16s RNA鉴定

对扩增的细菌16s RNA片段进行凝胶电泳，在750 bp处出现目的条带，把电泳析出的目的条带样品送到测序公司进行测序，与GenBank（NCBI）上已有序列进行比对，鉴定为绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa）.

3.2 病毒检测

3.2.1 目的片段

根据针对疱疹病毒聚合酶基因的保守序列设计通用引物[17]，扩增出了疱疹病毒聚合酶的目的基因片段.

3.2.2 凝胶电泳、测序及序列比对

扩增出的疱疹病毒聚合酶基因片段进行PCR检测，凝胶电泳后在所有检测样品中出现目的片段，大小约为238 bp，测序结果如表1所示.将其与GenBank（NCBI）上已知病毒的序列进行比对，该序列与玛卡病毒属（Macavius）聚合酶基因 13831（NCBINo.HM2164-57.1）相似度为86%.

表1 PCR产物测序结果Tab.1 Sequence of PCR products

3.2.3 免疫组织化学染色结果

在显微镜下观察免疫反应后的组织病理切片，发现麋鹿的肝脏组织内有呈现棕色或棕黄色的颗粒或团块（抗原阳性信号），结果如图1所示.

图1 疱疹病毒免疫组织化学染色结果（40倍）Fig.1 Immunohistochem ical staining result of herpesvirus

3.2.4 电镜观察结果

在肝脏、脾脏、肾脏3种组织细胞中均见有直径约150～200 nm的圆形带囊膜的病毒样粒子，如图2所示.

图2 肝脏可见病毒样颗粒Fig.2 Virus-like particles in liver

4 讨论与结论

本次麋鹿发病急，病程短，有明显的出血病变，在口腔组织中分离到绿脓杆菌，其他病变组织中未分离到，疑为继发感染所致.在病变组织中观察到直径约150～200 nm的圆形带囊膜的病毒样粒子，疱疹病毒特异性免疫组织化学反应呈阳性，经PCR方法鉴定该病毒属于疱疹病毒.综合分析认为本次麋鹿为感染疱疹病毒引起发病死亡.

疱疹病毒科包括100多种病毒，至少有16种疱疹病毒可以自然感染反刍动物，其中，6种为甲亚科疱疹病毒，9种为丙亚科疱疹病毒，另外1种未完成分类[18].不同种疱疹病毒的致病性不尽相同，存在较大差异.如甲型亚科的牛疱疹病毒[13]、山羊疱疹病毒[19]、鹿疱疹病毒[20]等均可感染反刍动物，经呼吸道传播造成病毒血症后，通常在生殖道表面出现病变.丙亚科疱疹病毒感染致单核细胞增多、脾肿大或恶性卡他热，可造成多种草食动物死亡，尤其圈养反刍动物极为易感[13].本次麋鹿发病，口腔黏膜、鼻黏膜、眼结膜、阴门黏膜及全身的淋巴结、脏器都出现病变并在病变组织中找到疱疹病毒，可以确诊为疱疹病毒感染引起.该病毒的测序结果与GenBank（NCBI）上已知病毒序列进行比对时，所得序列与丙亚科玛卡病毒属聚合酶基因13831（NCBI：No.HM216457.1）较接近，但相似度仅为86%，不能确定该病毒隶属于玛卡病毒属，也不排除可能是疱疹病毒的一个新属，目前的检验条件尚不能满足继续鉴定的要求.

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