红笛鲷IRAK-4基因cDNA全长的克隆及组织表达分析

黄郁葱，鲁义善，简纪常，吴灶和

（1.中国科学院南海海洋研究所，广东 广州510301；2.中国科学院大学，北京100049 ；3.广东海洋大学水产学院 //4.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东 湛江524088；5.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225）

红笛鲷IRAK-4基因cDNA全长的克隆及组织表达分析

黄郁葱1，2，3，4，鲁义善3，4，简纪常3，4，吴灶和4，5

（1.中国科学院南海海洋研究所，广东 广州510301；2.中国科学院大学，北京100049 ；3.广东海洋大学水产学院 //4.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东 湛江524088；5.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225）

白细胞介素-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase 4，IRAK-4）是一种参与机体先天性免疫和适应性免疫反应过程中的关键分子。采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增（RACE-PCR）的方法从红笛鲷（Lutjanus sanguineus）头肾中克隆 IRAK-4基因的 cDNA 全序列（登录号：KF279357）。该序列全长2 015 bp，包含5′ 非编码区（5′ UTR）205 bp，3′ 非编码区（3′ UTR）421 bp，开放阅读框（ORF）1 389 bp，编码462 个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为52.0 ku，理论等电点为5.19。氨基酸序列比对结果显示，红笛鲷IRKA-4基因氨基酸序列与其他物种的同源性为54.2%～85.7%。系统进化分析结果显示，红笛鲷与斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）聚为一支，两者有较近的亲缘关系。用荧光定量PCR 分析红笛鲷基因的组织表达差异，红笛鲷IRKA-4 基因在各组织中均有不同程度的表达，其中在皮肤、肝脏和胃中表达量最高，其次是胸腺、鳃、心脏、肠、肌肉和脾脏，在头肾、后肾和脑的表达量最低。

红笛鲷；IRAK-4；基因克隆；组织表达

先天性免疫是机体抵抗病原入侵的第一道防线，它的启动主要依赖于模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别病原体病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）［1］。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为机体最重要的模式识别受体之一，通过启动不同信号途径参与机体的先天性免疫与获得性免疫调节，在宿主防御微生物感染中起重要作用［2-5］。白细胞介素-1受体相关激酶（interleukin-1 receptor-associated kinase，IRAK）是TLR信号通路中的重要接头分子，在信号通路中发挥重要的枢纽作用。迄今为止，哺乳类的 IRAK家族共鉴定出 4个成员：IRAK-1、IRAK-2、IRAK-M 和IRAK-4。其中IRAK-1和IRAK-4 在信号通路中起正向调节作用，IRAK-2和 IRAK-M 则起负向调节作用［6-10］。该家族所有成员均有一个保守的N-端死亡结构域（Death Domain，DD）、中央激酶区域（Kinase Domain，KD）和较长的C端区域（不包括IRAK-4）。IRAK-4 是IRAK家族中最重要的一种激酶［10-11］，通过该激酶和接头分子的作用，介导一系列胞内的信号转导，最终诱导包括前炎症细胞因子等一系列基因的表达［7-12］。IRAK-4基因缺陷的小鼠 IL-1R/TLR 信号通路被严重阻断，抑制了NF-κB 激活和炎症因子的产生，不能有效抵抗细菌和病毒攻击，表明IRAK-4在先天性免疫中起关键作用［13］。此外，IRAK-4的激酶失活可抑制动脉粥样硬化的形成［14］。

目前，斑马鱼（Danio rerio）［15］、松江鲈鱼（Trachidermus fasciatus）［16］、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）［17］、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）［18］、石斑鱼（Epinephelus coioides）［19］等多种鱼类的IRAK-4 基因相继得到克隆鉴定。研究发现，不同鱼类的IRAK-4组织分布不同，且在受病原细菌、寄生虫及病毒刺激后表达量上调［15-19］，表明鱼类IRAK-4 在鱼体抵御病原侵染的免疫反应中可能发挥着重要作用。红笛鲷（Lutjanus sanguineus）是我国南方沿海地区重要的经济鱼类之一，然而近年来养殖规模的不断扩大和养殖环境不断恶化，病害频繁暴发，给其养殖业造成巨大经济损失［20］。本研究运用RT-PCR 方法克隆到IRAK-4 cDNA 全序列，并分析其基因结构特征和相应的氨基酸序列及组织分布，为阐明该基因在抵御病原感染过程中的作用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料

健康红笛鲷（80～100g）购自湛江某海水养殖场，大肠杆菌DH5α和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）由广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室保存。RNAlater 购自Ambion公司，Trizol购自 Invitrogen 公司，TransStart Green qPCR SuperMix 试剂盒购自全式金生物技术公司，Ex-taq、LA-taq、M-MLV 逆转录酶、SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 等购自TaKaRa 公司，Gel Extraction Kit 购自Omega 公司。

1.2组织采样

实验鱼暂养1周后，随机选取健康红笛鲷3 尾，分别取肝、头肾、脾、肾脏、脑、心脏、鳃、皮肤、肌肉、肠和胃组织，立即投入 RNAlater 中，转入-80℃超低温冰箱保存备用，收集的组织主要用于cDNA 克隆和组织分布分析。

1.3总RNA提取和cDNA一链合成

按Trizol说明书分别提取组织总RNA。用凝胶电泳检测 RNA完整性，用紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，保证其D（260 nm）/D（280 nm）在1.8～2.0。所提取的各组织总RNA经Dnase I消化后，按照M-MLV说明书合成cDNA第一链用于后续实验。另取头肾的总RNA，按SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 说明书分别合成用于3′ 与5′ RACE 扩增的cDNA 模板。

1.4引物设计与中间片段扩增

根据GenBank上已登录的IRAK-4基因核苷酸序列（Gadus morhua，HM046453；Plecoglossus altivelis altivelis，AB469846）的保守区域设计简并引物IRAK-4F与IRAK-4R（表1），扩增红笛鲷IRAK-4 基因的部分序列。降落PCR反应条件如下：94℃ 下预变性4min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，5个循环；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，5 个循环；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃下延伸5min，4℃条件下保存。PCR 反应产物经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后，与pMD-18T Vector连接转化DH5α，阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1　实验中所用的引物序列Table 1 Sequences of primers used for cloning and expression

1.5IRAK-4 基因3′ 与5′ 端扩增

根据简并引物扩增获得的部分序列，设计IRAK-4 cDNA全长的3′ RACE 和5′ RACE 引物（表1）。IRAK-4F1、IRAK-4R1分别与试剂盒自带的UPM Mix引物进行3′ 与5′ RACE第一轮降落PCR扩增。反应条件为：94℃下预变性3min；94℃ 30s，68℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，64℃30s，72℃ 2min，5个循环；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 2min，25 个循环；72℃下延伸5min，4℃条件下保存。将第1轮PCR 产物稀释20倍作为第2轮的模板，分别IRAK-4F2、IRAK-4R2与试剂盒引物NUP进行第2轮降落PCR扩增，反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30s，62℃ 45s，72℃ 2min，30个循环；于72℃下延伸5min，4℃条件下保存。余下步骤同1.2.3。

1.6生物学信息分析

扩增获得的序列使用DNAMAN6.0进行序列拼接，利用NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列同源性比对和相似性分析，采用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）和ExPASy Proteomics Server（http://ca.expasy.org）推导氨基酸序列、确定开放阅读框（ORF）、计算分子质量mM和预测理论等电点pI等，通过在线分析软件 SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）预测信号肽序列，采用 TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）预测跨膜结构域，用NetGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc）和NetPhos2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白质N-糖基化位点和磷酸化位点，用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）和InterProScan Sequence Search（http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）分析蛋白质结构功能域，亚细胞定位预测采用PSORT II Prediction（http://psort.hgc.jp/form2.html）。采用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）预测蛋白二级结构。采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1）预测蛋白质三维结构，使用ClastalX 2.0 及MEGA 6.0 软件，以邻位相连法（neighbor-joining）构建系统进化树。

1.7红笛鲷IRAK-4基因的组织表达分析

利用引物reIRAK-4F、reIRAK-4R与内参基因β-actin引物β-actinF、β-actinR，通过荧光定量PCR分析红笛鲷 IRAK-4基因在各组织中的表达。将合成的cDNA 第一链用无菌ddH2O适当稀释后作为荧光定量PCR 的模板，以红笛鲷β-actin为内参基因，利用ABI7300 实时荧光定量PCR仪分析红笛鲷IRAK-4基因的表达量，每个样本设3个重复。PCR反应条件为：94℃预变性 3min，94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环。PCR反应结束后以各组织中最低的mRNA 表达量为基准，通过2¯ΔΔCT方法计算红笛鲷IRAK-4 基因在不同组织中的相对表达量。

2　结 果

2.1IRAK-4基因的全长cDNA序列分析

红笛鲷IRAK-4基因cDNA序列全长2 015 bp（GenBank登录号KF279357），包含5′ 非翻译区（5′UTR）205 bp，3′ 非翻译区（3′ UTR）421 bp，开放阅读框1 393 bp，编码462个氨基酸（图1）。3′ UTR含一加尾信号（AATAAA）和不稳定基序（ATTTA）。

图1　cDNA序列及推导的氨基酸序列Fig.1　cDNA sequence and deduced amino acid sequence

2.2IRAK-4氨基酸组成和蛋白结构分析

根据推导的氨基酸序列，预测其理论分子质量为52.0 ku，等电点为5.19。该基因氨基酸序列含有一个典型的IRAK家族所有的死亡结构域（1～104 aa）、丝氨基酸/苏氨酸激酶结构域（183～462 aa）及蛋白激酶家族的特征基序，如蛋白激酶 ATP 结合域信号（protein kinase ATP-binding region signature，LGEGGFGTVYKGLLNDKPVAVKK）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点信号（Serine/Threonineprotein kinases active-site signature，HVHRDVKSANILLD）（图 1）。利用 SignalP 4.0 Server 程序对红笛鲷 IRAK-4 氨基酸序列进行 N端信号肽结构的预测，未发现有信号肽序列。用TMHMM Server v.2.0 程序预测，发现该蛋白不存在跨膜区。用NetNGlyc 1.0预测，发现其含有4个N-糖基化位点。用NetPhos 2.0软件预测，发现共有17个丝氨酸磷酸化位点，10个苏氨酸磷酸化位点，3个酪蛋白激酶磷酸化位点。

通过SOPMA软件进行二级结构分析，结果显示，在 IRAK-4蛋白的二级结构中，α-螺旋占37.88%，β-转角占7.58%，无规卷曲占41.77%，延伸链占12.77%（图2）。将红笛鲷DD和S_TKc氨基酸序列提交至 SWISS-MODEL 程序，自动搜索同源蛋白作模板，得到IRKA-4三级结构模型。结果显示，红笛鲷DD空间结构与小鼠的DD高度相似（图3），包括6个α螺旋；红笛鲷S_TKc 空间结构与小鼠的S_TKc高度相似（图4）。

图2　SOPMA 软件对IRAK4 蛋白二级结构的分析结果Fig.2　Secondary structure of IRAK-4 protein analyzed by SOPMA

图3　预测的红笛鲷IRAK-4 DD（a）与小鼠的IRAK-4 DD（b）空间结构的比较Fig.3　Comparison of the predicted 3D structure between sanpper IRAK-4（1 - 106 aa）and solution structure of the death domain from mouse IRAK-4（PDB ID:1wh4，chain A）

图4　预测的红笛鲷IRAK-4 的S_TKc（c）与人IRAK-4 的S_TKc（d）空间结构的比较Fig.4　Comparison of the predicted 3D structure of IRAK-4（183-462 aa）and crystal structure of the S_TKc　from human IRAK-4（PDB ID:2NRU，chain B）

2.3氨基酸同源性比较及系统进化分析

利用Clustal X2.0软件，对红笛鲷IRAK-4和NCBI 数据库已登录的其他物种的IRAK-4 进行氨基酸序列同源性比对分析，结果如图5所示，红笛鲷与其他物种的IRAK-4具有不同程度的同源性，其中红笛鲷IRAK-4与斜带石斑鱼（E.coioides）、松江鲈鱼（T.fasciatus）和半滑舌鳎（C.semilaevis）的IRAK-4同源性较高，同源率分别为高达85.7%、82.7%和72.2%，与爪蟾（Xenopus tropicalis）的同源性最低，为52.1%。

续图5 (Continued)

利用MEGA 6.0 的Neighbor-joining 法构建的IRAK-4 基因系统进化树见图6。图6显示，红笛鲷首先与鲈形目的石斑鱼（E.coioides）聚在一起，然后再与其他鱼类聚成一个大的分支，两栖类、鸟类和哺乳类聚在一起，与鱼类形成两个独立的进化分支。

2.4IRKA-4 组织表达分析

IRKA-4 在被检测的鳃、脑、肌肉、皮肤、肠、头肾、脾脏、肝脏、心脏等组织中均有不同程度的表达，在皮肤、肝脏和胃中表达量最高，其次为胸腺、鳃、心脏、肠和脾脏，在脑中的表达量最低（图7）。

图6　基于NJ 法构建IRAK-4氨基酸序列系统进化树Fig.6　Phylogenetic tree of snapper and other vertebrate IRAK-4s constructed with the Neighour-Joining method

图7　红笛鲷IRAK-4基因的组织表达Fig.7　Tissue distribution of IRAK-4 in healthy snapper

3　讨 论

本研究通过同源克隆和RACE PCR技术获得红笛鲷IRAK-4基因，该基因cDNA全长2 015 bp，开放阅读框1 393 bp，编码462个氨基酸，分子质量为52.0 ku，等电点为5.19。与已发现的其他鱼类和哺乳动物的IRAK-4类似，红笛鲷IRAK-4基因编码的氨基酸序列具有保守的死亡结构域和激酶结构域。

在TLR/IL-1R信号通路中，IRAK-4通过其死亡结构域与接头分子MyD88、IRAK-2的死亡结构域相互作用，组装成一个称为“myddosome”的紧密连接复合体［21］，同时IRAK-1被募集至受体复合物，并与IRAK-4紧密接触，从而使IRAK-1的KD区磷酸化并激活 IRAK-1，引发后续的信号传导。在哺乳动物IRAK-4死亡结构域中，参与复合体分子间相互连接的关键氨基酸残基（R12、V16、R20、F25、Q50、F51、R54、E69、T76、N78、A95）高度保守。在红笛鲷和其他硬骨鱼中 V16则变异较大，分别被L/H/F/Y所取代，被看作是TLR信号通路分子共同进化的一个证据，因为MyD88中的连接碱基同样发生了变异［18］。此外，硬骨鱼中与IRAK-2相连接的F25和F51同样发生较大的变异，在红笛鲷中F51被N取代，由于目前在鱼类中尚未发现IRAK-2，故这两个碱基变异是否对IRAK-4与IRAK-2间的连接产生影响尚需要进一步研究。建模结果显示，红笛鲷IRAK-4的死亡结构域含有6个α螺旋，与小鼠的死亡结构域高度相似，同时还含有一个保守的关键碱基W74，该碱基在小鼠中位于三维结构的疏水性核心，介导α螺旋的空间连接［22］。根据死亡结构域空间结构的高度相似性和关键氨基酸残基的保守性，推测鱼类IRAK-4与哺乳动物IRAK-4的结构和功能相似。

激酶结构域是IRKA-4的另一个重要功能结构域，哺乳动物IRAK-4的激酶结构域包含一个对蛋白激酶活性起关键作用的激活环，IRAK-4激酶活性主要依赖激活环上 3个特定的氨基酸（T342、T345和S346）自磷酸化［14］，由该3个氨基酸的定点突变结果，发现催化活性分别降至57%、66%和50%［23］。红笛鲷的IRAK-4激酶结构域中前面的两个苏氨酸酸残基（T342、T345）与哺乳动物相同，但第3个丝氨酸残基被谷氨酸取代，导致该自磷酸化位点的缺少，该位点的缺失是否会导致其激酶活性下降有待进一步的研究。同时红笛鲷蛋白激酶ATP 结合域信号含有两个重要的赖氨酸（KK213），这两个赖氨酸在其他鱼类和哺乳动物中高度保守，突变可导致人IRAK-4激酶活性丧失［24］。在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点信号序列中保守的天冬氨酸残基（D340）在红笛鲷中同样存在，对于其保持激酶活性至关重要［25］。此外，在红笛鲷 IRAK-4还含有一个被称为“gatekeeper”的酪氨酸，它是IRAK家族4个成员所特有的氨基酸，目前已被证实在激酶选择性结合各种小分子和 ATP 竞争抑制剂方面发挥重要作用［25］。

在哺乳动物中，IRAK-4广泛表达于各种组织中，其中在肾脏和肝脏表达量最高［24］。目前的研究表明，鱼类 IRAK-4在各个组织均有不同程度的表达，斑马鱼和斜带石斑鱼的 IRAK-4在头肾和脾脏中表达量最高［15，19］，表明其在免疫系统中具有重要作用。然而本研究显示，IRAK-4在红笛鲷的皮肤和肝脏中表达量最高，与松江鲈鱼的研究结果相似［17］。皮肤是鱼类防御病原侵染的第一道防线，IRAK-4在皮肤中的高量表达预示着其可能在抵御外源病原入侵中发挥重要作用。鱼类 IRAK-4在细菌、病毒寄生虫刺激后表达量上调或下调［15，17-19］，表明鱼类 IRAK-4对不同刺激物具有不同的免疫应答机制。同时鱼类 IRAK-4转染实验发现，其功能与哺乳动物不同，显著削弱NF-κB活性，其确切的作用机制尚不清楚。因此，今后通过构建真核表达载体，转染鱼类细胞探索其对鱼类细胞TLR/IL-1R信号通路的影响，分析其调节免疫细胞功能及抗病原微生物免疫反应中的功能和作用机制，将为我们进一步了解 IRAK-4在鱼类免疫系统中的作用提供新的理论依据。

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（责任编辑：刘庆颖）

Full-length cDNA Cloning and Tissue Expression Analysis of IRAK-4 Gene from Humphead Snapper (Lutjanus sanguineus)

HUANG Yu-cong1，2，3，4，LU Yi-shan3，4，JIAN Ji-chang3，4，WU Zao-he4，5
（1.South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China； 3.Fisheries College，Guangdong Ocean University //4.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088，China； 5.Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China）

Interleukin-1 receptor-associated kinase 4（IRAK-4）is a key molecular which participates in the innate immune and adaptive immune processes.In this paper，full length cDNA sequence of IRAK-4 gene was amplified by RT-PCR and RACE PCR from head kidney of humphead snapper，Lutjanus sanguineus（GenBank accession number:KF279357）.The total cDNA sequence of humphead snapper IRAK-4 was 2 015 bp，including 3' UTR of 421 bp，5' UTR of 205 bp，an open reading frame（ORF）of 1 389 bp encoding 462 amino acids with Molecule Mass of 52.0 ku and pI of 5.19.The deduced amino acid sequence of humphead snapper IRAK-4 shared 54.2% - 85.7% identities with other species IRAK-4.Phylogenetic analysis showed that humphead snapper was clustered closely with orange-spotted grouper.In addition，the mRNA expression levels in different tissues were analyzed byreal time quantitative PCR.The result showed that humphead snapper IRAK-4 expressed in all examined tissues with highest levels in skin，liver and stomach，moderate levels in thymus，gill，heart，intestine，muscle and spleen，and lowest levels in head kidney，kidney and brain.

Lutjanus sanguineus； IRAK-4； gene cloning； tissue expression

Q78；Q959.483

A

1673-9159（2015）01-0018-10

2014-12-30

十二五国家科技支撑计划（2012BAD17B03），广东省海洋经济创新发展区域示范专项（GD2012-B01-004），国家自然基金（41240041）

黄郁葱（1978-），男，讲师，主要从事水产动物病害防治。E-mail :hyczjou@163.com

吴灶和，教授，主要从事水产动物免疫学及病害控制。E-mail :wuzaohe@163.com