异丙醇/柠檬酸三钠双水相体系萃取分离栀子苷的研究

李 婷，郭晶莹，李永斌，张红萍

（邵阳学院生物与化学工程系，湖南 邵阳 422000）

异丙醇/柠檬酸三钠双水相体系萃取分离栀子苷的研究

李 婷，郭晶莹，李永斌，张红萍

（邵阳学院生物与化学工程系，湖南 邵阳 422000）

采用异丙醇和柠檬酸三钠组成的双水相体系萃取分离技术从栀子果粉中获得高收率的栀子苷。用紫外分光光度法测定，栀子苷的标准曲线为C=0.029A+0.048，R2=0.998。实验选用与水互溶的常见低分子有机溶剂异丙醇与柠檬酸三钠作为双水相体系的组成物质，研究体系组分含量变化时栀子苷在上下相中的质量浓度，确定异丙醇/柠檬酸三钠体系萃取栀子苷的最佳条件为：双水相体系的总量为10mL，V异丙醇/V水=7/3（mL），柠檬酸三钠的质量为1.1g，栀子苷的收率达99.87%。

栀子苷；异丙醇；柠檬酸三钠；双水相体系萃取

栀子别名黄果子，是茜草科植物栀子的果实，为常见传统中药，具有凉血解毒、清热利尿、泻火除烦等功效［1-2］。作为经鉴定的药食两用资源，栀子的果实中含有多种环烯醚萜类物质成分，其中的主要活性成分栀子苷具有消炎利胆、抗氧化等作用，目前在医药、保健、生物检测等行业有着广泛的应用［3-5］。双水相体系萃取技术作为一项新型生化分离技术，与传统的分离技术相比具有操作条件温和、处理能力强、易于连续化操作等诸多优点，被广泛应用于金属分离、生物工程和药物分析等领域。过去对双水相体系的研究大部分限于高聚物体系［6-7］，表面活性剂和相关离子液体的双水相体系也偶有研究。最新研究发现，能与水互溶的某些有机溶剂在无机盐的作用下也能形成稳定的双水相平衡体系，这类萃取分离体系的显著优点是传质和分相速度快，原料成本低，所使用的有机溶剂易回收处理，操作简便，高效环保，表现出良好的分离性能［8-10］。本文用异丙醇和柠檬酸三钠组成的双水相体系萃取栀子苷，确定了异丙醇/柠檬酸三钠体系萃取栀子苷的最佳条件，提高了栀子苷的收率。

1　材料和方法

1.1材料和试剂

以栀子果粉为供试材料（符合中国药典标准），栀子苷标准品（110749-201316）。

异丙醇、碳酸钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、碳酸钾、柠檬酸三钠等。实验所用试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.2仪器与设备

UV-2100紫外-可见分光光度计，分析天平，TGL-16G离心机。

1.3方法

1.3.1上下相中栀子苷的含量

配制总量为10mL的异丙醇和无机盐双水相体系，加入0.02g栀子苷。搅拌振荡6min，静置片刻至溶液分相完全，转至离心管内于离心机中以转速2000r·min-1离心6min，离心后读取上相和下相的体积，取样分析计算上相和下相的栀子苷含量。相关计算公式为：

式中：Vt、Vb分别为双水相体系上、下相的体积，mL； Ct、Cb分别为双水相体系上、下相栀子苷的质量浓度，mg·mL-1。

1.3.2制作栀子苷标准曲线

采用紫外-可见分光光度法，在波长238nm下测定栀子苷标准品的吸光度。测得栀子苷标准曲线的回归方程为C=0.029A+0.048，R2=0.998。且在质量浓度0.005～0.05mg·mL-1范围内线性关系良好。

2　结果与分析

2.1盐的确定

配制5份总量相同的异丙醇和水溶液，分别向各试管中逐量递增地加入碳酸钠、硫酸钠、氯化钠、氯化钾、柠檬酸三钠，混合均匀，置于试管中比较分相情况。结果表明，异丙醇/水的萃取体系中，柠檬酸三钠的分相能力强，与其它盐形成体系时不分层或分层模糊，故试验选取柠檬酸三钠。

2.2异丙醇/盐最佳体系的确定

2.2.1最佳的异丙醇-水两相体积比的确定

异丙醇与水的混合液总量为10mL，异丙醇的初始体积为V始，按不同的体积比配成混合液，再向不同体积比的混合液中等量递增地加入柠檬酸三钠形成双水相体系。记录每次加完盐后上相体积V终。计算V终/V始的比值。改变异丙醇的初始添加量，测定柠檬酸三钠用量对异丙醇相体积变化的影响，实验结果见图1。

图1　柠檬酸三钠的用量对异丙醇相体积的影响Fig1. Effect of isopropanol phase volume of the amount of trisodium citrate

异丙醇的初始体积较小时，加入大量的盐也不能形成双水相，异丙醇初始溶剂量小时，分相所需要的盐量较多。在这种富盐环境中，少量含有机溶剂的水合分子滞留在其中。进一步增大盐的浓度，由于盐夺取了水分子，有机溶剂因此被释放出来。初始异丙醇溶剂量大时，分相所需盐量较小。对于不同初始溶剂量的异丙醇，随着盐量的增加，V终/V始趋近于1，说明双水相的分相过程是无机盐与有机溶剂争夺水分子的过程。当异丙醇初始体积达 9mL时，下相黏浊难以操作。从上述数据中可以看出V异丙醇为7mL，V水为3mL时，0.5g柠檬酸三钠刚好能使异丙醇与水分相。V终/V始的值近乎趋近于1，说明两相的分配几乎完全达到平衡，所以异丙醇/水的最佳体积比为7∶3。

2.2.2体系中柠檬酸三钠用量的确定

确定了异丙醇与水的最佳体积比后，需要实验分析恰好形成双水相时柠檬酸盐的最低用量。当V异丙醇为7mL、V水为3mL 时，V终/V始趋近于1，盐的添加量为1.0g。在初始浓度相同的条件下，改变柠檬酸三钠在体系中的添加量，观察盐量对相比、分配系数和收率的影响。分别加入不同质量的柠檬酸三钠，栀子苷的添加量为 0.02g。柠檬酸三钠的用量对相比、分配系数和收率的影响见表1。

由表1可知，异丙醇/柠檬酸三钠双水相体系中，随着盐量的不断增加，其相比、分配系数和收率也随之变化。加入1.1g盐时效果最好，分配系数和收率达最大，分配系数K为117.80，收率Y为99.87%。

3　结论

实验表明，双水相体系的分相过程是一个有机溶剂和无机盐争夺水分子的过程。当有机溶剂加入量小时，体系分相所需要的无机盐的含量较大。当加入有机溶剂的量大时，分相所需要的无机盐的量较小。随着无机盐添加量的增加，V终/V始值趋近于1。由上述实验确定，异丙醇/柠檬酸三钠双水相体系的总体积为10mL，栀子苷为0.02g，异丙醇与水的初始体积比为7/3时，V终/V始趋近于1，所用盐量为1.1g。此条件下体系两相分离完全，栀子苷的收率为99.87%。

表1　柠檬酸三钠的用量对栀子苷在异丙醇/柠檬酸三钠双水相体系中的影响Tab.1 affect the amount of sodium citrate geniposide in isopropanol / sodium citrate aqueous two-phase systems

［1］ 刘晓棠，赵伯涛，张玖，等.栀子的综合开发与利用［J］.中国野生植物资源，2008，27（1）：19-23.

［2］ 齐雅静，顾军强，王立，等.栀子果功能性成分研究进展［J］.食品工业科技，2013，34（14）：363-369.

［3］ 伏建峰，杜晖俐，史清海，等.栀子苷的定向分离提取方法建立［J］.西北国防医学杂志，2013，31（1）：1-4.

［4］ 游伟良，平其能，孙敏捷，等.栀子苷的药理学研究新进展［J］.药学进展，2012，36（4）：158-162.

［5］ 马新起，周慧，高景曦，等.栀子提取技术开发研究进展［J］.时珍国医国药，2007，18（2）：493-494.

［6］ 李丽敏，尚庆坤.亲水有机溶剂/无机盐双水相萃取技术在分离提纯生物物质中的应用［J］.光谱实验室，2011，28（6）：3073-3078.

［7］ 薛绍玲.栀子中栀子苷的分离纯化工艺研究［D］.南宁：广西大学，2007.

［8］ 梁华正，李媛，杨水平.利用双水相萃取栀子黄废液中的栀子苷酶法生产栀子蓝色素的研究［J］.食品化学，2009，30（3）：155-158.

［9］ 辜鹏.无机盐/低分子有机物双水相体系的研究及其应用［D］.湘潭：湘潭大学，2008.

［10］ 刘绍鹏，宗志敏，魏晴，等.双水相体系中成相及有机物分配机理的初步研究［J］.化工时刊，2010，24（12）：21-24.

Separation of Geniposide by Aqueous Two-phase Containing Isopropanol and Salt Extraction System

LI Ting， GUO Jing-ying， LI Yong-bin， ZHANG Hong-ping
（Department of Biology and Chemistry Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China）

Isopropanol/salt aqueous two-phase system was used to extract geniposide. Measured by UV spectrophotometry， the standard curve of geniposide was C=0.029A+ 0.048， R2= 0.998. Common low molecular experiment， water-miscible organic solvent isopropyl alcohol and sodium citrate was used as the composition of the material aqueous two-phase systems， the infl uence of system component content on geniposide mass concentration in extraction system was studied. The optimum extraction conditions were：total aqueous two-phase system was 10mL， V（isopropanol）/V（water）=7/3（mL）， sodium citrate quality was 1.1g， yield of geniposide was up to 99.87%.

geniposide； isopropanol； sodium citrate； aqueous two-phase extraction system

R 284.2

A

1671-9905（2015）11-0003-05

邵阳市科技局科技项目（2014GK34）；邵阳学院研究生科研创新项目（ CX2014SY012）

李婷（1989-），女，湖南衡阳人，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全

张红萍，教授，E-mail：zhp4901@163.com

2015-09-09