白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系产生肿瘤坏死因子α、活化信号分子p38MAPK的影响

段志敏 杜蕾蕾 曾荣 沈永年 胡素泉 刘维达 陈青 李岷

·论著·

白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系产生肿瘤坏死因子α、活化信号分子p38MAPK的影响

段志敏 杜蕾蕾 曾荣 沈永年 胡素泉 刘维达 陈青 李岷

目的 探讨白念珠菌对人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞系）分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）和细胞内信号分子p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活的影响。方法 实时荧光定量PCR分析105、106CFU/ml灭活白念珠菌及阳性刺激物脂多糖刺激THP-1细胞1、3、6 h后TNF-α mRNA表达水平变化。40 μg/L地塞米松预先与THP-1细胞共培养30 min后，再用106CFU/ml白念珠菌、脂多糖刺激6 h后检测TNF-α mRNA表达水平。酶联免疫吸附法检测白念珠菌刺激THP-1细胞24 h后TNF-α分泌量。免疫印迹法分析白念珠菌体外作用THP-1细胞30 min、1 h后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。结果 105CFU/ml白念珠菌、106CFU/ml白念珠菌、脂多糖刺激THP-1细胞组以及空白对照组TNF-α mRNA表达水平差异有统计学意义（F=110.98，P<0.001）；白念珠菌刺激 1、3、6 h 之间差异也有统计学意义（F=701.680，P<0.001），随培养时间延长，THP-1细胞TNF-α mRNA水平增高，呈时间依赖效应。106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后24 h，TNF-α蛋白水平（6385.70±533.99 ng/L）较空白对照组（147.10±0.53 ng/L）明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。106CFU/ml白念珠菌作用于THP-1细胞30、60 min后磷酸化p38MAPK蛋白水平也明显升高。40 μg/L地塞米松预先与THP-1细胞共培养30 min后，再以106CFU/ml白念珠菌刺激6 h后TNF-α mRNA表达水平（3.77±0.62）较未用地塞米松组（208.50±10.50）明显降低，地塞米松可阻断白念珠菌上调TNF-α mRNA水平。结论 人THP-1细胞体外与白念珠菌作用后激活信号分子p38MAPK并分泌TNF-α，参与抗念珠菌感染固有免疫反应。

白色念珠菌；白血病，单核细胞，急性；肿瘤坏死因子α；p38丝裂原活化蛋白激酶类；细胞系，肿瘤

念珠菌是常见的正常人体寄生菌群，但在宿主环境状态发生变化时可从共生状态转化为致病状态。侵袭性念珠菌病在接受免疫抑制治疗的器官移植患者和癌症患者中常见，念珠菌血症在院内感染中占第4位，死亡率可达15%~35%，而白念珠菌是最常见的致病念珠菌［1］。因此，研究人体的免疫反应在抗白念珠菌过程中的作用极为重要。在宿主的固有免疫中，单核巨噬细胞对识别、清除入侵的白念珠菌起重要作用［2］。本研究旨在探讨白念珠菌能否激活人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1）的信号分子p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及诱导肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的分泌。

材料和方法

1.菌株、细胞和主要试剂：白念珠菌ATCC32354由中国微生物菌种保藏管理委员会医学真菌中心提供，56℃30 min水浴灭活后，配制成不同浓度菌悬液待用。THP-1细胞株购自美国模式培养物集存库（ATCC）。兔抗人p38MAPK和磷酸化p38MAPK抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品；iTaq Universal SYBR Green Supermix为美国Bio-rad公司产品；PrimeScript RT Master Mix逆转录酶试剂盒为日本TaKaRa公司产品；TNF-α酶联免疫吸附试剂盒为欣博盛公司产品；丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）、脂多糖为美国Sigma公司产品；地塞米松为美国Invivogen公司产品。

2.细胞培养：人THP-1细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养、传代。将细胞制备成105个/ml细胞悬液，接种于6孔细胞培养板（每孔2 ml）及12孔细胞培养板（每孔1 ml），加入100 μg/L PMA刺激48 h后，加入不同浓度白念珠菌共培养。

3.实时荧光定量逆转录PCR法检测白念珠菌与THP-1细胞共孵育不同时间点TNF-α mRNA表达水平：105和 106CFU/ml白念珠菌与 105个/ml THP-1细胞共孵育，并设培养基空白对照组、阳性刺激物100 μg/L脂多糖组、地塞米松抑制组（40 μg/L地塞米松预先与细胞共培养30 min）。设置多个白念珠菌与THP-1细胞共孵育时间点，根据预实验，刺激1 h后TNF-α mRNA表达水平开始升高，3 h后继续升高，6 h后表达水平达到最高，继续延长作用时间后TNF-α mRNA表达水平开始降低。本实验选择1、3、6 h作为观察时间，地塞米松抑制组仅选择刺激效果最强的6 h作为观察时间。Trizol法抽提总RNA，按PrimeScript RT Master Mix逆转录酶试剂盒说明书将1 μg总RNA反转录为cDNA。使用实时定量PCR仪7300型（美国ABI公司），采用Syber green法对目的基因进行扩增。以β肌动蛋白作为内参照，引物TNF-α及β肌动蛋白由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列TNF-α上游 5′-CGAGTGACAAGCCTGTAGC-3′，下游 5′-GGTGTGGGTGAGGAGCACAT-3′，β 肌动蛋白上游5′-TCTGGCACCACACCTTCTA-3′， 下 游 5′-AGGCATACAGGGACAGCAC-3′，反应条件：预变性95 ℃ 10 min，变性 95 ℃ 15 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循环数 40。采用 2-△△Ct法计算目的基因的变化水平，ΔCt=目的基因Ct值-β肌动蛋白Ct值；样品ΔΔCt=样品ΔCt-对照组样品ΔCt。以对照组目的基因表达量为1，2-△△Ct值即为实验组目的基因较对照组目的基因表达的倍数。

4.酶联免疫吸附试验（ELISA）：收集上清液后按照试剂盒说明书检测上清液中TNF-α含量。根据预实验，106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后，上清液TNF-α含量升高更明显。设置不同的刺激时间，发现刺激24 h后上清液TNF-α含量达到最高。本实验选择24 h作为观察时间。

5.Western印迹法：收集与白念珠菌菌悬液共培养的THP-1细胞，裂解细胞，提取总蛋白。等量蛋白的不同样品梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至聚偏二氟乙烯膜上。5%牛血清白蛋白（BSA）封闭2 h，兔抗人单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST液（Tris-Buffered Saline Tween-20）洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG第二抗体反应2 h，TBST液洗膜3次，Supersignal试剂显色发光，检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。根据预实验，106CFU/ml白念珠菌刺激THP-1细胞后磷酸化p38MAPK的水平升高更明显。设置不同的刺激时间发现，刺激30 min后磷酸化p38MAPK的水平开始升高，刺激1 h后达到最高。

6.统计学处理：应用SPSS19.0统计软件，计量资料以±s表示。不同时间不同组别间或不同组别不同处理间TNF-α mRNA表达水平的比较采用双因素方差分析；不同组别间TNF-α蛋白含量的比较采用单因素方差分析，并采用LSD-t检验对不同处理因素间进行两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.白念珠菌对THP-1细胞TNF-α mRNA水平的影响：刺激后 1、3、6 h，经双因素方差分析，不同浓度白念珠菌组、脂多糖组、空白对照组TNF-α mRNA表达水平差异有统计学意义（F=110.983，P<0.001，v=3），白念珠菌刺激 1、3、6 h 之间差异也有统计学意义（F=701.680，P<0.001，v=2），THP-1细胞TNF-α mRNA水平随培养时间延长增高，呈剂量依赖效应。见表1。

2.白念珠菌对THP-1细胞TNF-α蛋白分泌的影响：106CFU/ml白念珠菌刺激后24 h，白念珠菌组、脂多糖组、空白对照组的上清液中TNF-α蛋白分别 为 （6385.70 ± 533.99）、（3212.06 ± 353.00）、（147.10±0.53）ng/L，经单因素方差分析，3组间差异有统计学意义（n=8，F=71.25，P<0.01），白念珠菌组、脂多糖组分别与空白对照组比较，TNF-α蛋白分泌量均明显升高，差异有统计学意义（P值分别<0.01、<0.05）。

表1 白念珠菌对HTP-1细胞TNF-α mRNA表达水平的影响（2-△△Ct±s）

表1 白念珠菌对HTP-1细胞TNF-α mRNA表达水平的影响（2-△△Ct±s）

注：与空白对照组比较，a：P<0.05；b：P<0.001；c：P<0.01

组别 刺激后1 h 刺激后3 h 刺激后6 h 105CFU/ml白念珠菌组 3.65±1.15 8.27±0.28a169.93±12.35b 106CFU/ml白念珠菌组 7.22±0.78c10.79±0.84c205.10±12.13b脂多糖组（100 μg/L） 6.94±0.69c25.27±1.82b148.45±6.43b空白对照组 1.23±0.11 0.84±0.21 1.09±0.31

3.白念珠菌对THP-1细胞p38MAPK激活的影响：白念珠菌刺激后30 min，与空白对照组相比，磷酸化p38MAPK蛋白水平已升高，60 min时持续升高；而p38MAPK蛋白水平在刺激后30 min、1 h均没有变化。见图1。

4.地塞米松对白念珠菌上调TNF-α mRNA水平的影响：40 μg/L地塞米松预先与THP-1细胞共培养30 min后，再用106CFU/ml白念珠菌、脂多糖刺激6 h TNF-α mRNA表达水平见表2。经统计分析，3组是否采用地塞米松TNF-α mRNA表达水平差异有统计学意义（F=3 320.025，P<0.01，v=2），地塞米松可阻断白念珠菌上调TNF-α mRNA水平。

讨 论

作为抗感染免疫反应的第一道防线，固有免疫反应在抗白念珠菌感染中发挥重要作用，其中起主要作用的细胞包括单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞。单核巨噬细胞对识别、清除入侵的白念珠菌起重要作用。本研究旨在探讨THP-1在白念珠菌刺激后相关的信号分子p38 MAPK如何活化，是否诱导TNF-α的分泌，从而研究人体免疫反应在抗白念珠菌过程中如何发挥作用。本实验将白念珠菌灭活后与THP-1细胞共培养，既保留了白念珠菌的基本形态，又避免真菌分泌的各种蛋白酶对THP-1细胞产生影响，同时防止白念珠菌在与细胞共培养过程中繁殖太快，使细胞与真菌的比例易于量化。

图1 白念珠菌对THP-1细胞p38MAPK激活的影响 1：空白对照组；2：加白念珠菌刺激30 min；3：加白念珠菌刺激1 h。加白念珠菌刺激后30 min，与空白对照组相比，磷酸化p38MAPK蛋白水平已有升高，60 min时持续升高；而p38MAPK蛋白水平在刺激后30 min、1 h则均没有变化

表2 地塞米松对白念珠菌上调THP-1细胞TNF-α mRNA水平的影响（±s）

表2 地塞米松对白念珠菌上调THP-1细胞TNF-α mRNA水平的影响（±s）

注：a：与空白对照组比较，P<0.001；b：与未用地塞米松阻断组比较，P<0.001

组别 未用地塞米松阻断 地塞米松阻断白念珠菌组 208.50±10.50a 3.77±0.62b脂多糖组 161.35±1.65a 6.20±1.93b空白对照组 1.09±0.07 0.89±0.27

有研究证明，TNF-α可促进白细胞介素12（IL-12）、干扰素γ的产生，并介导树突细胞向炎症部位迁移，有助于清除新生隐球菌感染［3］。在体外建立的三维皮肤感染模型中，以TNF-α、IL-22同时刺激角质形成细胞能够有效阻止白念珠菌的生长并保持表皮细胞的完整性［4］。TNF-α基因敲除小鼠对白念珠菌的易感性增加，与对照组相比中性粒细胞的募集及对白念珠菌的吞噬作用明显减弱［5］。类风湿性关节炎患者在使用TNF-α单克隆抗体治疗后出现原有真菌感染的复活或初发慢性真菌感染的报道逐渐增多［6］，且念珠菌感染在所有非结核杆菌感染中最常见［7］。可见TNF-α在抗白念珠菌感染中发挥重要作用。

本研究初步发现，两种浓度的白念珠菌作用THP-1细胞后，上调TNF-α mRNA水平均出现时间依赖效应，在刺激3 h后出现上升，刺激6 h后105CFU/ml白念珠菌组mRNA水平为3 h的20.5倍，106CFU/ml组则升高19.0倍。本研究采用脂多糖（Toll样受体4的配体）作为激活THP-1细胞的阳性对照物，也能诱导出相同的时间依赖效应，刺激6 h后TNF-α mRNA水平比3 h组上升3.9倍。106CFU/ml作用THP-1细胞24 h后，上清液中TNF-α含量较空白对照组明显升高，表明白念珠菌不仅在mRNA水平诱导THP-1细胞上调TNF-α的转录，而且在蛋白水平提高该因子的分泌量。

在机体受到病原微生物感染或组织损伤后，激活固有免疫细胞的细胞膜表面及胞质内的模式识别受体（RPR）。识别白念珠菌的RPR主要包括Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）和C型凝集素受体两类，TLR2、TLR4在机体抗白念珠菌感染中发挥重要作用，活化下游的MAPK，主要包括细胞外调节激酶（ERK）、p38及 c-Jun氨基末端激酶（JNK）几个亚族；p38MAPK作为MAPK家族成员之一，其主要功能是将胞外的信号传递至胞内，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞功能调控［2］。p38MAPK被激活后可以使一些转录因子如转录活化因子1（ATF-1）、ATF-2、CREB 及 AP-1的丝氨酸和苏氨酸位点磷酸化，使这些转录因子活化，从而调节靶基因的表达［7］。p38MAPK激活后能影响细胞因子的产生，有研究证实p38MAPK通路特异性阻断剂SB203580可以抑制单核细胞IL-1和TNF的产生［8］。p38MAPK的激活可诱导多种基因的表达，共同调节炎症反应，是促进TNF-α产生的重要活化分子。本实验结果表明，白念珠菌刺激后30 min，已出现p38MAPK蛋白磷酸化，60 min时p38MAPK磷酸化水平显著升高，提示白念珠菌可诱导p38MAPK途径出现活化，调节TNF-α等前炎症因子的转录。

地塞米松是一种合成的糖皮质激素，具有强大的抗炎活性。有实验证据表明，地塞米松通过阻断MAPK通路来抑制炎症介质基因的表达［9］。在本实验中，将人THP-1细胞与适当浓度的地塞米松预先共培养30 min后，再用106CFU/ml白念珠菌、脂多糖刺激，TNF-α mRNA表达水平明显减低，提示地塞米松可通过阻断MAPK通路影响下游TNF-α的表达。

综上所述，白念珠菌对人THP-1细胞刺激后可出现p38MAPK蛋白磷酸化，TNF-α在mRNA水平、蛋白水平表达量升高，并且在一定程度内呈现剂量依赖性、时间依赖性。表明人THP-1细胞体外与白念珠菌共培养后激活信号分子p38MAPK并分泌TNF-α，参与抗念珠菌感染固有免疫反应。

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Effects ofCandida albicanson the expression of tumor necrosis factor-α and activation of the intracellular signaling molecule p38MAPK in a human acute monocytic leukemia cell line THP-1

Duan Zhimin*,Du Leilei,Zeng Rong,Shen Yongnian,Hu Suquan,Liu Weida,Chen Qing,Li Min.*Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College;Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs,Nanjing 210042,China

ObjectiveTo investigate the effects ofCandida albicanson the expression of tumor necrosis factorα（TNF-α）and activation of the intracellular signaling molecule p38 mitogen-activated protein kinase（p38MAPK）in a human acute monocytic leukemia cell line THP-1.MethodsSome THP-1 cells were divided into several groupsin vitro:twoC.albicansgroups treated with 105CFU/ml and 106CFU/ml heat-killedC.albicansrespectively,a lipopolysaccharide （LPS）group treated with 100 μg/L LPS,a blank control group treated with RPMI 1640 medium,two dexamethasone-inhibited groups pretreated with 40 μg/L dexamethasone for 30 minutes followed by treatment with 106CFU/ml heat-killedC.albicansand LPS respectively.After treatment for 1,3 and 6 hours,real-time fluorescencebased quantitative PCR was performed to measure TNF-α mRNA expression in THP-1 cells in the above groups.Enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to determine the level of TNF-α protein in the supernatant of THP-1 cells treated with 106CFU/ml heat-killedC.albicans,100 μg/L LPS or RPMI 1640 medium（blank control group）for 24 hours.Western blot was performed to measure the protein expression of p38MAPK and phosphorylated p38MAPK in THP-1 cells after treatment with 106CFU/ml heat-killedC.albicansor RPMI 1640 medium （blank control group）for 30and 60 minutes.Statistical analysis was carried out by using two-way analysis of variance,one-way analysis of variance and the least significant difference（LSD）-ttest.ResultsSignificant differences were observed in the mRNA expression level of TNF-α among theC.albicansgroups,LPS group and blank control group （F=110.98,P<0.001）.The mRNA expression level of TNF-α in THP-1 cells increased over time in a time-dependent manner afterC.albicanstreatment,with significant differences among different time points （F=701.680,P<0.001）.Compared with the blank control group,both 106-CFU/mlC.albicansgroup and LPS group showed a significant increase in TNF-α protein expression（6385.70±533.99 ng/L and 3212.06±353.00 ng/L vs.147.10±0.53 ng/L,P<0.001 and 0.005,respectively）.An obvious increase was observed in the expression level of phosphorylated p38MAPK protein,but no significant changes were noted in that of p38MAPK protein,in THP-1 cells treated with 106CFU/mlC.albicansfor 30 and 60 minutes compared with the blank control group.The mRNA expression level of TNF-α significantly decreased in dexamethasonepretreated 106-CFU/mlC.albicansgroup and LPS group compared with those without dexamethasone pretreatment（3.77±0.62 vs.208.50±10.50,6.20±1.93 vs.161.35±1.65,bothP<0.001）.Conclusions Heat-killedC.albicanscan induce the activation of p38MAPK in and secretion of TNF-α by human THP-1 cells,which then participate in the innate immune response againstC.albicans.

Candida albicans;Leukemia,monocytic,acute;Tumor necrosis factor-alpha;p38 Mitogen-activated protein kinases;Cell line,tumor

s:Li Min,Email:minli08@gmail.com;Chen Qing,Email:qngchen@hotmail.com

作者单位：210042南京，中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所，江苏省皮肤性病分子生物学重点实验室（段志敏、杜蕾蕾、曾荣、沈永年、胡素泉、刘维达、李岷）；江苏省血液中心（陈青）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.004

国家自然科学基金（81371750、81101734）；江苏省自然科学基金（BK2011128）；江苏省“六大人才高峰”项目（2013-WSW-039、2013-WSW-090）；江苏省“333 高层次人才培养工程”项目

李岷，Email：minli08@gmail.com；陈青，Email：qngchen@hotmail.com

2014-07-28）

（本文编辑：颜艳）