药用植物地黄不同部位粗提液体外抑菌活性的比较研究

李玉玺　刘俊华　马海玲

摘 要：采用分光光度法分析比较了药用植物地黄不同部位乙醇提取液的体外抑菌活性。以地黄花、叶、根等3个部位为试验材料，以80%乙醇为提取溶剂，制备乙醇提取液，以常见致病菌金黄色葡萄球菌为受试菌株，测定各处理菌悬液OD值，并计算抑菌率。研究结果表明，地黄不同部位醇提液对金黄色葡萄球菌均有抑制作用，不同部位抑菌效果不同，其中以地黄叶醇提液抑菌作用最强，当浓度为80g/L时，其对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到72.43%，MIC为5.0g/L，EC50值为10.651g/L，并且其对金黄色葡萄球菌的抑制作用与提取液质量浓度间正相关性最为显著。

关键词：地黄；乙醇提取液；最低抑菌浓度；分光光度法

中图分类号 S482.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）20-24-03

Abstract：To study the inhibition effects of Ethanol extracts from different part of the medicinal plant Rehmannia glutinosa on Staphylococcus aureus，ethanol-extracts from Rehmannia glutinosa were obtained with normal methods，and the liquid medium with different mass concentration of extracts from the flowers，leaves and roots of Rehmannia glutinosa were prepared，then oscillated the liquid medium of Staphylococcus aureus，which had been inoculated，and the bacteriostasis effects were tested by Spectrophotometric method. The results showed that Staphylococcus aureus was inhibited by the ethanol extracts of Rehmannia glutinosa，but different parts extracts had different inhibition effects，and the bacteriostasis activity was Leaf（72.43）>Flower（55.86%）>Root（55.42%） at the concentration of 80g/L. The MIC and EC50 of Leaf were 5.0g/L and 10.651g/L. The ethanol extracts of three parts of Rehmannia glutinosa all had inhibitory action on Staphylococcus aureus，and the ethanol extract of Rehmannia glutinosa leaves had stonger inhibitions activities than the extracts of other two parts，and the bacteriostatic effects was obviously along with the increase of concentration of ethanol extracts.

Key words：Rehmannia glutinosa；Ethanol extract；MIC；Spectrophotometric method

地黄（Rehmannia glutinosa）为玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）多年生直立草本植物[1]，其块根是我国著名的传统常用大宗中药材[2-4]，已有研究多集中于地黄的产地适宜性、人工栽培、化学成分分析和营养学等方面[5-7]，而关于地黄提取液抑菌性方面的研究相对缺乏。

本文以药用植物地黄的花、叶、根部为植物材料，以80%乙醇为提取溶剂，以金黄色葡萄球菌为受试菌株，测定了地黄植物体不同部位醇提液的抑菌活性，分析比较了地黄叶、花、根等不同部位乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度和抑菌中浓度，以期为开发以地黄为植物源的生物抑菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料 （1）仪器：LMQ.R立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）、LH系列层流洁净工作台（济南隆宏净化设备有限公司）、250B生化培养箱（江苏省金坛市医疗仪器厂）、FA1004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、756PC紫外-可见光分光光度计。（2）材料：本研究所用地黄材料采自滨州学院校园内；供试菌株为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus saccharolyticus），由滨州学院生命科学系微生物学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌基本培养基的配制 按陈金春等[8]的方法，配制营养琼脂和营养肉汤培养基，调节pH值为7.2。

1.2.2 菌种活化及菌液的制备 菌种活化参考赵锦慧等[9]的活化方法。无菌条件下挑取少许活化后的金黄色葡萄球菌放入无菌生理盐水中，摇匀后制备得菌悬液，调节其菌体密度为102cfu/mL。

1.2.3 地黄乙醇提取液的制备 将采集得到的地黄除杂洗净，自然阴干，后用剪刀分别将根、叶、花剪碎研磨成粉。分别准确称取各部位干粉8.0g，置于带塞广口瓶内，加50mL80%的乙醇，室温条件下静置浸提24h，然后用滤纸过滤除去残渣，收集滤液，并定容至100mL，即得质量浓度为80g/L的地黄各部位乙醇浸提液，于4℃冷藏避光保存，备用。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定 取冷藏备用的地黄各部位提取液母液（80g/L），依次对半稀释得到质量浓度为40g/L、20g/L、10g/L、5g/L、2.5g/L的醇提液，分别加入0.1mL菌悬液，同时设生长对照（菌悬液+80%乙醇+培养基）和清水对照（菌悬液+清水+培养基），培养12h后观察菌株生长情况，无菌生长的最低处理浓度即为乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的MIC。

1.2.5 提取液抑菌作用测定 采用分光光度计法测定地黄根、叶、花等3个部位醇提液对金黄色葡萄球菌的抑制作用。将分别装有5mL已灭菌LB液体培养基试管若干，置于超净工作台中紫外灭菌30min。于无菌条件下，准确量取3mL地黄各部位乙醇提取液和200μL金黄色葡萄球菌菌悬液分别加入上述试管中。另取1支装有5mL已灭菌LB液体培养基试管，加入3mL相应地黄提取液、200μL LB液体培养基，不接任何菌株作为空白对照；同时，取1支装有5mL已灭菌LB液体培养基试管，加入200μL金黄色葡萄球菌菌悬液和3mL已灭菌LB液体培养基，作为含菌对照。每一处理均为3次重复，置于摇床（37±0.5）℃下恒温培养24h后，使用紫外-可见光分光光度计测定600nm处菌悬液OD值，依据下式计算抑菌率：

抑菌率（%）=（1-处理组OD值/对照组OD值）×100

1.2.6 数据处理与分析 试验数据在Windows XP操作系统下应用Excel 2003进行汇总与整理，运用Spss19.0进行LSD多重比较和Duncan检验以及Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 最低抑菌浓度（MIC）的测定 本研究共设从0g/L～80g/L7个乙醇提取液浓度梯度，以测定地黄3个部位乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。由表1可以看出，地黄不同部位乙醇提取液对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度存在较大差异，其中以地黄叶乙醇提取液的抑菌效果最强，其MIC值为5.0g/L，即在5.0g/L质量浓度下即具有较强的抑菌效果；而地黄根和地黄花的醇提液MIC分别为10.0g/L、20.0g/L。

2.2 不同部位抑菌作用的比较分析

2.2.1 地黄不同部位醇提液的抑菌作用比较 图1为地黄不同部位醇提液处理样品600nm处的OD值。由图1可知，在低质量浓度下（2.5～20g/L），地黄根部、花部醇提液吸光值间无显著差异，而二者均明显高于地黄叶醇提液处理组吸光值；在中高浓度（40～80g/L）时，地黄叶醇提液OD值随着质量浓度增加的降幅明显，说明在较高质量浓度下，其抑制金黄色葡萄球菌生长的能力显著增强；当质量浓度为80g/L时，3个部位的抑菌作用为地黄叶>地黄花>地黄根。

2.2.2 地黄不同部位醇提液抑菌活性的浓度效应 对地黄提取液质量浓度和抑菌率间进行相关性分析，得不同部位乙醇提取液抑菌力回归方程（图2～图4）。由图2～4可知，随着地黄各部位醇提液质量浓度的增加，对金黄色葡萄球菌的抑制作用均呈明显递增趋势，且表现为对数式增长。

抑菌活性与提取液质量浓度间的相关性分析表明，地黄叶部醇提液抑菌力的浓度效应最为显著（R2=0.994，P=0.015），其次为花部（R2=0.983，P=0.024），而根部表现出的抑菌作用的浓度效应最不明显（R2=0.887，P>0.05）。

2.2.3 地黄不同部位醇提液抑菌中浓度（EC50） 依据图2～图4所得抑菌活性与提取液质量浓度的回归方程，计算得到地黄叶、花、根等部位醇提液对金黄色葡萄球菌的EC50值，分别为10.651g/L、41.814g/L、31.480g/L，表明地黄叶乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用要显著优于花部和根部。

3 结论与讨论

我国北方地区的地黄，其花期一般为4～5月份，最佳采收期为9～10月份，中药地黄为地黄的块根，是我国传统优势国药[10-12]。本试验初步研究了地黄不同部位乙醇提取液对金黄色葡萄球菌的抑制作用、最低抑菌浓度以及EC50值，结果表明，地黄不同部位乙醇提取液对金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，其叶片醇提液的抑菌效果要强于根部和花部。同时，从质量浓度与抑菌力相关性水平和回归方程来看，都表明地黄叶醇提液具有更强的抑菌效果，其最低抑菌浓度（MIC）和抑菌中浓度（EC50）等指标水平也明显低于根部和花部提取液。

本研究中，地黄叶醇提液表现出更强的抑菌作用，可能与研究所用地黄材料有关，可能是植物采集时地黄叶中积累了相对较多的次生代谢活性物质；已有研究表明，地黄叶具有比根部更丰富的梓醇资源，具有很高的开发价值[11]。本研究仅就地黄的根、叶和花等部位乙醇提取液抑菌活性进行了分析和比较，今后将开展不同极性溶剂提取物和抑菌机理方面的研究，以期为地黄资源的开发利用提供理论依据与技术参考。

参考文献

[1]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴[M].北京：科学出版社，2002：51-52.

[2]夏至，李家美.地黄属及其近缘属的药用植物资源调查研究[J].商丘师范学院学报，2009，25（12）：96-98.

[3]赵素霞，樊克峰，白雁.地黄资源情况分析[J].中药研究与信息，2003，5（5）：25-27.

[4]于相丽，杨柯金.怀地黄的研究进展[J].安徽农业科学，2005，33（9）：1720-1721.

[5]刘卫欣，卢兖伟，杜海涛，等.地黄及其活性成分药理作用研究进展[J].国际药学研究杂志，2009，36（4）：277-280.

[6]曾艳，贾正平，张汝学.地黄化学成分及药理研究进展[J].中成药，2006，28（4）：609-611.

[7]李更生，于震，王慧森.地黄化学成分与药理研究进展[J].国外医学中医中药分册，2004，26（2）：74-78，104.

[8]陈金春，陈国强.微生物学实验指导[M].北京：清华大学出版社，2005：37.

[9]赵锦慧，陈璨，刘中华，等.中草药凤尾草两种提取物的抑菌活性研究[J].时珍国医国药，2013，24（5）：1110-1111.

[10]杜红光.地黄不同炮制品中梓醇的含量测定研究[J].时珍国医国药，2004，15（9）：582-583.

[11]翟彦峰.地黄叶化学成分的研究[D].开封：河南大学，2010：17-30

[12]张艳丽，冯志毅，郑晓珂，等.地黄叶的化学成分研究[J].中国药学杂志，2014，1：15-21.

（责编：张宏民）