新疆紫草石油醚提取物对小鼠生殖组织形态及其脏器指数的影响

戴 冰，曹璐婷，肖子曾*，吴沁璇，曾呈茜，杨梦琳，张嘉倪

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙410208）

新疆紫草[Arnebia euchroma (Royle) Johnst]为2010 版《中华人民共和国药典》收载的紫草品种之一。 味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有清热凉血、活血解毒、透疹消斑等功效，是临床常用的中药[1]。 现代药理研究发现新疆紫草具有良好的抗早孕、 抗生育作用，课题组前期研究发现，新疆紫草石油醚提取物是其抗生育作用的药效部位[2]，但对其抗生育的毒性研究少有报道。 故通过开展对新疆软紫草石油醚提取物的蓄积毒性试验研究，对促进新疆紫草作为抗生育新药的研发，确保其在育龄妇女用药安全得以逐步实现，丰富、发展中药妊娠用药禁忌理论提供一定的实验依据。

1 材料

1.1 受试物

新疆紫草 （购自湖南中医药大学第一附属医院，批号1307220462；经湖南中医药大学第一附属医院药剂科检验鉴定为新疆紫草。

1.2 试验动物

昆明种小鼠，雌雄各半，健康适龄，体质量18～22 g，共40 只，SPF 级，购自湖南中医药大学，许可证号：SCXK（湘）2013-0004；饲养处及试验地：湖南中医药大学实验动物中心SPF 级实验室。

1.3 主要仪器与试剂

RE-52A 旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂)；LEICA DM LB2 型双目显微镜(德国LEICA 公司)；Shandon325 型石蜡切片机(英国Shandon 公司)；Motic B5 显微摄像系统(麦克奥迪实业集团公司)。

2 方法

2.1 新疆紫草石油醚提取物的制备[3]

称取3 kg 新疆紫草50 ℃干燥6 h 后粉碎。 将新疆紫草粉末平均分三份（每份1 kg）于渗漉筒中，加10 倍体积石油醚，浸泡12 h，以2 mL/min 的流速渗漉提取一个月，富集提取液，减压回收溶剂。 浓缩液挥干溶剂后称重，计算每份固形物得率（相对于生药材），分别为2.75%、2.68%、2.63%，平均固形物得率为2.69%。 动物试验前以4%吐温-80 助溶，50 ℃水浴加热搅拌配制成混悬液备用。

2.2 蓄积毒性试验及蓄积系数计算

取昆明种小鼠40 只，雌雄各半，采用20 d 剂量递增蓄积毒性试验法[4]，将小鼠随机分为对照组和试验组，每组20 只。 以10 mL/kg 鼠重灌胃，对照组给以4%吐温-80 水溶液，试验组小鼠给以配制的新疆紫草石油醚提取物混悬液， 以4 d 为一周期，初始给药剂量为0.1 倍LD50（LD50按课题组急性毒性试验所得数据3.48 g/kg 计算），1.5 倍递增量每期递增， 连续给药到小鼠累积死亡一半时结束试验，共计17 d。计算累积给药剂量以及蓄积系数K=LD50(n)／LD50。

2.3 脏器指数测定及生殖器官病理观察

进行毒性试验后，待解剖小鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉（350 mg/kg）。解剖雄性小鼠取睾丸，雌雄小鼠取卵巢和子宫，精密电子天平称取各脏器质量后于10%甲醛溶液中固定。 计算脏器指数，即脏器(mg)与活体体质量(g)之比。 采集的组织经过常规脱水、石蜡包埋、切片、烘烤、脱蜡、复水、HE 染色后光学显微镜下观察。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 新疆紫草石油醚提取物小鼠蓄积毒性试验结果

给药第17 天小鼠累积死亡总只数达到10 只，累积给药剂量为13.08 g/kg， 相当于生药材486.25 g/kg，蓄积系数K=3.76，根据蓄积毒性评价标准[5]，当K≥5 时，为弱蓄积性；当3≤K＜5 时，为中等蓄积性；当1≤K＜3 时，为强蓄积性。 结果表明新疆紫草石油醚提取物为中等蓄积毒性。

3.2 新疆紫草石油醚提取物对小鼠生殖器官脏器指数的影响

试验组雄性小鼠睾丸指数与对照组比较无显著性差异（P＞0.05），而试验组雌性小鼠卵巢和子宫指数与对照组比均差异具有统计学意义 （P＜0.05），表明长期灌胃新疆紫草石油醚提取物对雄性小鼠睾丸组织无蓄积毒性影响，但可减轻雌性小鼠卵巢和子宫质量。 结果见表1。

表1 新疆紫草石油醚提取物对小鼠生殖器官脏器指数的影响 （n=10，±s）

表1 新疆紫草石油醚提取物对小鼠生殖器官脏器指数的影响 （n=10，±s）

注：与对照组比较*P＜0.05。

组 别对照组试验组给药剂量（g/kg）—13.08睾丸指数（对）6.60±1.00 7.21±0.83卵巢指数（对）0.94±0.12 0.81±0.11*子宫指数3.49±0.23 3.14±0.28*

3.3 新疆紫草石油醚提取物对小鼠生殖器官组织形态的影响

对照组雄性小鼠睾丸生精小管内细胞排列紧密，可见精原细胞、精母细胞以及大量精子细胞位于生精小管腔面，精子排列有序，睾丸间质细胞完好。 与对照组相比试验组雄性小鼠睾丸病理组织观察无明显病变。

对照组雌性小鼠卵巢内各级卵泡细胞生长发育正常，轮廓清晰，初级卵母细胞核大而圆，可见少量闭锁卵泡。 小鼠子宫大多处在增生期或分泌期，腺体排列密集，内膜较厚，组织细胞结构正常。 与对照组相比试验组小鼠卵巢内各级卵泡细胞，卵母细胞发育正常，未发现细胞结构异常的病变，但闭锁卵泡数目明显增加， 小鼠子宫大多处于增生前期，腺体较少，内膜相对对照组较薄，组织细胞结构基本正常。 表明新疆紫草石油醚提取物对试验组小鼠卵泡和子宫发育有一定影响，但对其细胞结构均无病理性损伤。 结果见第72 页彩图图1～3。

4 讨论

石油醚是提取新疆紫草脂溶性萘醌类成分的主要溶剂，其挥发性强，极性较低；且由于新疆紫草萘醌类成分是一类天然色素，高温下容易变性或者分解。 因此本试验根据前期对新疆紫草石油醚提取工艺的考察结果[6]，采用石油醚渗漉法冷浸提取该类成分，制得新疆紫草石油醚提取物，发现其得率较高且稳定。 同时还由于该提取物不溶于水，故在进行动物试验给药时，用4%吐温-80 助溶量，水浴加热搅拌配制成混悬液给药。

脏器指数反映药物对脏器的影响，是初步的毒性判断。 该指数增加表示脏器有充血、水肿、增生、肥大等变化，指数下降表示脏器萎缩、退行性变化等[5]。 脏器指数的比较结果在一定程度上可说明药物毒性作用的影响程度， 支持或印证病理检查结果。 本试验发现新疆紫草石油醚提取物为中等蓄积毒性，可降低雌性小鼠卵巢指数和子宫指数（卵巢和子宫质量）， 但对雌性小鼠卵巢和子宫组织形态无毒性损害，其细胞结构基本正常；表明该提取物可能导致雌性小鼠生殖组织的生长发育受到抑制，从而起到抗生育作用。 这与戴德英，罗学娅发现紫草在抗生育药理作用中可能使雌性小鼠的卵巢和子宫质量下降，但对组织并无损害作用，其抑制作用是可逆的报道一致[6-7]。 究其原因可能与新疆紫草石油醚提取物干扰垂体对卵巢的调节作用，降低雌孕激素水平[8-9]，抑制小鼠卵巢内卵泡的成熟以及子宫内性腺的发育，使得闭锁卵泡数目增多，子宫内膜壁变薄，从而导致卵巢和子宫的质量减轻有关。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：320.

[2]戴 冰，邹双华.新疆紫草系统溶剂法提取分离部位的抗生育作用研究[J].中药材，2007，27(9)：1 120-1 122.

[3]沈建忠.动物毒理学[M].北京：中国农业出版社，2002：83-102.

[4]戴 冰，周新蓓，尹爱武，等.新疆紫草四种溶媒系统提取物紫草素含量测定及急性毒性的试验研究[J].中国中医药科技，2005，12(3)：168-169.

[5]石东霞，杨 帆，殷中琼，等.印楝油对小鼠的急性毒性试验和蓄积毒性研究[J].中国兽医科学，2010，40（3）：317-320.

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[7]罗学娅，李明辉，吕 莉.紫草的药理作用与应用研究进展[J].大连大学学报，2004，25(2)：80-83.

[8]马保华，邴鲁军，王浙民.中药紫草抗生育作用的研究[J].山东医科大学学报，1993，31(1)：35.

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