冷诱导RNA 结合蛋白在急性脑外伤后的表达变化及其促炎作用研究

刘雨潇，刘文佳，苏宁，张志文，薛菁辉

1.解放军总医院 第一附属医院，北京 100048；2.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071

急性脑外伤是神经系统的常见疾病，具有较高的致死率，且容易引发多种脑损伤后遗症如偏瘫、癫痫、失语等，给病人及其家庭带来了极大的痛苦。急性创伤后的损伤修复一直是神经科学研究的难点。因此，深入研究脑外伤的致病机制，提高该疾病的临床诊治水平具有重要意义。冷诱导RNA 结合蛋白（cold-inducible RNA binding protein，CIRP）是冷激蛋白家族成员，该蛋白包含一个N 端共有序列RNA结合域（consensus sequence RNA-binding domain，CS-RBD）和一个C 端富甘氨酸结构域[1]。CIRP 的核酸及氨基酸组成在种间具有高度的保守性和较高的同源性，人与小鼠CIRP CS-RBD 序列的相同性达99%，富甘氨酸结构域序列相同性达91%。CIRP 在动物的脑、肺、肾脏、肝脏、胃、结肠等组织中结构性低表达，并在应激原的诱导下表达升高，广泛参与低温保护、神经及胚胎发育等一系列生物学过程，是一种重要的生理活性物质[2-3]。我们在前期研究中发现CIRP 对神经细胞的损伤修复具有调控作用[4]。肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，在炎症的发生过程中发挥着重要的调控作用。本研究中，我们着重观察CIRP 在急性脑外伤发病过程中的表达变化，以及该分子与炎症因子TNFα之间的关系，探讨其在脑外伤发病过程中的作用，为该疾病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康成年雄性昆明白小鼠46 只，体重20～25 g，由军事医学科学院实验动物中心提供。动物于常温下饲养，自由进食饮水。随机分为正常组（n=10）、手术组（n=36）。

10%水合氯醛、2%盐酸利多卡因、0.9%氯化钠注射液（武汉博士德公司）；牙托粉和牙托胶（上海齿科材料厂）；兔抗CIRP 多克隆抗体（美国CST 公司）；TRIzol试剂（Invitrogen 公司）；反转录试剂盒（大连宝生物公司）；液压颅脑损伤仪（美国NEWSUN公司）。

1.2 小鼠急性脑损伤模型的制作

用10%水合氯醛麻醉动物，将其头部固定在立体定向仪上，固定过程中要求人字缝与前囟保持水平；沿中线切开头皮及皮下组织，充分暴露前囟和人字缝，选择前囟后2 mm、矢状缝右侧2 mm 作为圆心，用磨钻钻直径2 mm 的骨孔磨，须保持硬膜完整；清洁骨窗边缘，采用和好的牙科水门汀连接连接管，并用生理盐水注满连接管，以排出连接管内气泡；将连接管接入液压打击仪打击口，将打击力度调整到1.8～2.0 atm 以造成重度脑外伤，液压瞬间打击到暴露的硬膜上，打击压力由外接压力传感器记录。

1.3 实时PCR检测CIRP和TNFα mRNA的表达

分别于损伤后24及48 h脱颈处死实验动物（每个时间点18只实验组动物、5只正常组动物），TRIzol法提取每个时间点9 只小鼠损伤部位脑组织及3 只正常小鼠相同脑区RNA，反转录获得cDNA 模板，进行实时定量PCR扩增。

20 μL 实时荧光定量PCR 检测体系包括1×Real Master Mix，1×SYBR Green，CIRP基因的上、下游引物各1 μL（5 pmol）及1 μL 模板。以β-actin基因作为内参照，每样品均做3 个复孔，以不加模板为空白对照。反应条件：94℃5 min 预变性；94℃30 s，52℃ 30 s，72℃ 40 s，30 个循环；72℃延 伸10 min。扩增后获得各组Ct 值，绘制标准曲线，用基于ΔΔCt方法进行相对定量分析，基因表达差异为2ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt样品-ΔCt参考基因。

β-actin上游引物为5′GATCCACATCTGCTGG AAGG3′，下游引物为5′AAGTGTCGTTGACATCCG 3′；TNFα上游引物为5′CCTGTAGCCCACGTCGTAG 3′，下游引物为5′GGGAGTAGACAAGGTACAACCC 3′；CIRP上游引物为5′GGACTCAGCTTCGACACCA AC3′，下游引物为5′ATGGCGTCCTTAGCGTCATC3′。

1.4 大脑标本的HE染色

另取24、48 h 时间点9 只实验组、2 只正常组小鼠制备大脑标本。实验鼠用2%水合氯醛腹腔注射麻醉、4%多聚甲醛心脏灌注后取出脑组织，将脑组织置于4%多聚甲醛中固定48 h后进行石蜡包埋及切片，切片厚度为8 μm。

石蜡切片经常规脱蜡、水合后，将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟，酸水及氨水中分色各数秒钟，流水冲洗1 h 后入蒸馏水片刻，入70%和90%酒精中脱水各10 min，入酒精伊红染色液染色2～3 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片观察。

1.5 大脑标本的免疫组化检测

采用间接免疫荧光法检测损伤及正常大脑组织中人特异抗原CIRP的表达水平，一抗工作浓度为1∶200。石蜡切片脱蜡至水，用3% H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS 浸泡2 次，每次5 min；用5%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h 或4℃过夜；PBS冲洗3 次，每次5 min；滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10～30 min；PBS 缓冲液冲洗3 次，每次5 min；滴加适量辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育30 min；PBS缓冲液冲洗3次，每次5 min；显色剂显色3～15 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

1.6 统计分析

采用Student′st检验分析损伤后不同时间点损伤脑组织与正常脑组织CIRP 表达水平的差异，P＜0.05 表示差异显著；采用统计软件Graphpad prism 6分析CIRP表达水平与TNFα表达水平的相关性。

2 结果

2.1 建立小鼠急性脑损伤模型

对照组小鼠大脑左右对称，未见明显病理变化。液压打击可导致小鼠大脑急性损伤，损伤程度与范围随打击力度增大而增大。液压打击后，可观察到小鼠大脑皮层、蛛网膜下腔及脑挫裂伤灶周围出血，损伤越重，出血越明显。伤后数小时，大脑挫裂伤灶逐渐形成坏死空洞。24 h 可见伤侧脑组织苍白、损伤部位组织水肿，坏死灶明显。此外，行为学观察发现手术组小鼠出现偏瘫、行动困难等症状。HE 染色结果显示，急性脑损伤48 h 后大脑局部出现明显的组织缺损；小鼠在打击部位白质内可见大量神经元坏死、胶质细胞增生和空洞样结构形成；空洞位于原出血区，呈类圆形，周围有增生的胶质细胞包绕（图1）。

2.2 免疫组化染色观察

建模48 h 后，免疫组化染色观察CIRP 蛋白在损伤部位的表达情况。结果发现，损伤侧大脑组织标本中可以观察到更多CIRP 阳性细胞，呈黄色或淡黄色，染色阴性的神经元细胞核经苏木精复染呈蓝色，与正常大脑相比损伤大脑CIRP 阳性细胞数显著增加（图2）。

2.3 损伤后不同时间点CIRP mRNA表达水平检测

以正常大脑为对照，采用实时PCR 方法检测损伤后不同时间点大脑损伤部位CIRP 的表达变化情况，结果发现急性脑损伤24 及48 h 后CIRP 的表达持续升高，与对照组相比具有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.4 损伤后不同时间点炎症因子TNFα mRNA 表达水平检测

采用实时PCR 方法，在大脑急性损伤后不同时间点检测炎症因子TNFα的表达变化，结果发现与正常脑组织相比，TNFα在大脑损伤后显著增多，提示脑损伤会诱导炎症因子的分泌（图4）。

图1 小鼠缺急性脑外伤模型的建立

图2 正常大脑及脑损伤后48 h后观察CIRP在脑内的表达情况

2.5 急性损伤后脑组织中CIRP 的变化与TNFα表达水平的关系

为了进一步研究CIRP 在大脑损伤修复过程中的作用，我们利用统计学软件分析了CIRP 的变化与TNFα表达水平之间的关系，结果表明大脑急性损伤后，脑组织中CIRP 的表达量与炎症因子TNFα的表达水平存在线性关系，TNFα的表达水平随着CIRP表达量的增高而增高，两者具有线性相关。

3 讨论

图3 实时PCR检测急性脑损伤后不同时间点CIRP的表达

图4 实时PCR检测急性脑损伤后不同时间点CIRP的表达

图5 CIRP与TNFα mRNA表达水平相关性分析

流行病学研究发现急性脑外伤是交通事故、高空坠落等公共突发事件引发的常见病。我国急性脑外伤的发生率可占城市伤亡病总数的60%，该疾病容易导致永久性残疾和死亡，是严重影响人类生命健康的疾病之一[5-6]。创伤后脑组织的损伤修复对病人生活能力的改善至关重要。在临床治疗过程中，脑组织的创伤越严重，修复越困难。然而目前脑外伤发展过程中的调节机制还不明确。因此，建立适当的动物模型，研究调控脑外伤损伤修复的分子机制，对临床具有指导意义。

建立稳定的动物模型是脑外伤致病机理研究的基础。理想的脑外伤模型应具备以下特点：①具有良好的重复性，即采用相同方法制作出的模型具有相近程度的脑损伤；②具有良好的临床指导性，动物模型的损伤与所要研究的人类脑损伤具有相似的特征；③实验因素的可控性，即打击力度与大脑损伤程度线性相关，可通过对打击力的控制来控制动物脑损伤的程度；④操作简单易行。20 世纪以来，研究者采用多种方法建立了脑创伤动物模型，其中包括液压打击脑损伤模型、惯性加速脑损伤模型、固定冲击损伤模型、落重法闭合性脑损伤模型等[7-9]。有研究者比较上述模型后，认为采用液压打击法制作脑损伤模型操作简单、重复性好，可以很好地模拟临床复制出局灶性和弥漫性损伤[10]。小鼠具有与人类相似的基因序列，容易进行实验操作，是制作小动物脑损伤模型的最常用动物之一。因此，本研究以成年小鼠作为研究对象，采用液压打击法稳定制作出小鼠脑外伤模型，打击后的小鼠出现明显的脑外伤症状，且损伤程度与打击强度正相关。

我们在前期工作中发现，在缺血再灌注模型中CIRP 随着损伤时间的推移表达升高，然而CIRP 的表达与脑中能量代谢无线性关系[11]。2014 年，Zhou等研究发现在脑缺血模型中CIRP 促进了大脑的炎症反应[12]。本研究中首次利用实时PCR 及免疫组化法观察了CIRP 在急性脑损伤中的表达变化，结果发现大脑损伤部位的CIRP 表达持续升高。为了进一步研究CIRP 表达与大脑炎症之间的关系，我们检测了同一时间点炎症因子TNFα的表达水平，并分析了TNFα表达变化与CIRP 之间的关系，结果表明CIRP表达水平与TNFα表达水平呈线性相关。本研究进一步证实了CIRP 对炎症反应促进作用，与Zhou 等的研究结果一致。

尽管取得了上述进展，CIRP 发挥作用的具体机制尚不明确，有待深入研究。相信大脑损伤修复研究的不断深入，会在不久的将来为创伤性脑外伤的治疗带来新的希望。

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