元素分析-碳同位素比值质谱法在酿造酱油掺假鉴别中的应用

谭梦茹，林 宏，沈崇钰，吴 斌，张 睿，丁 涛，费晓庆，杨功俊（.中国药科大学药学院，江苏南京 98；.江苏出入境检验检疫局食品实验室，江苏南京 000）

元素分析-碳同位素比值质谱法在酿造酱油掺假鉴别中的应用

谭梦茹1，林 宏2，沈崇钰2，吴 斌2，张 睿2，丁 涛2，费晓庆2，杨功俊1
（1.中国药科大学药学院，江苏南京 211198；
2.江苏出入境检验检疫局食品实验室，江苏南京 210001）

为了加强对酱油的品质监管，采用元素分析-同位素比值质谱法（EA-IRMS）对国内酱油掺假情况进行了研究。基于来自国内各地区、各种类的86个纯正酿造酱油的碳同位素比值（δ13C值）数据库，提出了纯正酿造酱油中氨基酸δ13C值应不大于-21.50‰。依据这个判定准则，对58个日常样本进行检测，发现其中15个酿造酱油样品被掺入了酸水解蛋白调味液。实验结果表明，采用元素分析-碳同位素比值质谱法能够评估酱油的品质，可以作为酿造酱油品质保障和掺假鉴定的有效手段。

酿造酱油；元素分析-同位素比值质谱法（EA-IRMS）；掺假；酸水解蛋白调味液

酿造酱油（FSS）是以富含蛋白质的豆类和富含淀粉的谷类等为主要原料，在微生物、酶的发酵作用下，形成的具有特殊色、香、味的调味汁液［1］。配制酱油是指以酿造酱油为主体，与酸水解蛋白调味液（AHPS，包括酸水解植物蛋白调味液和酸水解动物蛋白调味液）、食品添加剂等配制而成的液体调味品［2］。酿造酱油的主要营养成分为氨基酸、糖类，因其具有良好的风味、丰富的营养，一直是人们烹饪首选的调味品。但是基于生产成本的因素，一部分生产商为了获取不当利益以配制酱油冒充酿造酱油。

卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单（第三批）》中指出，禁止在酱油中掺入由酸水解动物蛋白获得的毛发水，此外，在配制酱油中，FSS含量应不少于50%，且产品名称应标注为“配制酱油”。但目前市售酱油均标注为酿造酱油，这有可能存在以配制酱油冒充酿造酱油的情况。由于酿造酱油的掺假行为对调味品市场造成了极大的负面影响，损害了广大消费者的身体健康和经济利益，因此，有必要开发一种有效、灵敏的检测方法来鉴定酱油中是否存在外源性的AHPS。

目前，关于酿造酱油掺假鉴别的方法主要有气相色谱法［3］、电子鼻法［4］、高效液相色谱-串联质谱法［5］、气相色谱-质谱法［6］、红外光谱法［7］等，这些方法大都无法鉴别水解动物蛋白的掺假，并且存在操作复杂、检测成本高、检测过程存在有机试剂污染等问题。

在酱油的检测标准SN／T 3262—2012、SB／T 10417—2007和SB 10338—2000中［8-10］仅规定了酱油中乙酰丙酸和氯丙醇这两个检测指标。但李国基等［3］指出仅通过乙酰丙酸含量无法有效鉴别酱油的掺假，另外也有研究发现，通过改进生产工艺降低水解蛋白调味液中氯丙醇含量［11］可以解决氯丙醇污染的问题。因此，为了准确地鉴定酿造酱油中的掺假，需要建立新的指标和方法。植物光合作用的不同代谢途径在碳同位素上的生物歧视效应，使得碳-3和碳-4两种代谢途径产物的δ13C值有较大差异。酿造酱油的主要成分之一氨基酸来源于大豆中蛋白质的降解，由于大豆为碳-3代谢植物，最终酱油所含氨基酸为碳-3代谢产物。若酸水解植物蛋白的原料为玉米蛋白，由于玉米为碳-4代谢植物，水解所得的AHPS为碳-4代谢产物；另外，Raghavan等［12］研究表明，酸水解动物蛋白的原料（毛发、胶原蛋白等）的δ13C值也体现为碳-4代谢产物，并且采用盐酸水解这些动物蛋白，得到的产物氨基酸也被证明为碳-4代谢产物。因此可以利用两种代谢途径产物δ13C值的差异建立鉴别酿造酱油掺假的方法。

近年来，稳定同位素质谱技术逐渐成为鉴别食品成分掺假、产地溯源的一种有效而又绿色无污染的手段。目前，可以通过该技术实现对各种食品，如蜂蜜、油脂、葡萄酒、调味品等的掺假鉴定［13-19］，并可实现对果汁、乳制品和蔬菜等食品的产地溯源［10-22］。例如，费晓庆等［23］利用元素分析-同位素比值质谱联用法有效鉴定了蜂王浆中外源性碳-4植物糖的掺假。

本研究拟利用元素分析-同位素比值质谱（EA-IRMS）法对酿造酱油中掺入AHPS的检测进行初步研究，通过收集86个来自国内各个品种的纯正酿造酱油，建立酿造酱油的δ13C值数据库，提出鉴别酿造酱油中掺入碳-4来源AHPS的方法，以期为我国有关监管部门进一步开展酿造酱油的品质、真实性的监管工作提供科学根据和技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Flash 2500型元素分析仪，DELTA V Advantage同位素质谱仪：美国Thermo Scientific公司产品；FD115型恒温干燥箱：德国Bingder公司产品；锡杯（5 mm×3.5 mm）：英国Element microanalysis公司产品；RJ-LDL-50G型低速大容量多管离心机：无锡市瑞江分析仪器有限公司产品；WH-861型涡旋混合器：太仓市华利达实验设备有限公司产品。

碳同位素标准物质IA-R00513C甜菜糖（δ13C值为-26.03‰）：英国Sercon公司产品；氢氧化钙和硫酸：均为分析纯，南京化学试剂厂产品；实验用水：煮沸后冷却的无二氧化碳蒸馏水。

1.2 样品前处理

86个酿造酱油样品来自于国内不同地区的生产商，这些样本来源可靠，确认为酿造酱油。酱油品种涵盖了高盐稀态发酵酱油、高盐固稀发酵酱油、低盐固体发酵酱油3种主要生产方式，产地包括广东、四川、山东、北京、江苏、辽宁、内蒙古、黑龙江、安徽、湖北、贵州、甘肃和云南等省份。58个待检测的酱油样本（标签均标注为酿造酱油）和15个酸水解调味液样品来自国内超市，或是调味品企业委托检测的样品。以上样品均在4℃下密封保存。

样品前处理过程参照文献［24］，称取约10g均匀样品于50mL离心管中，加入10mL蒸馏水，用涡旋混合器均质2min后倒入1mL塑料离心管中，用5μL微量进样器移取1μL试样至锡杯中，用于酱油δ13C值的测定，每个样品平行测定2次，取平均值，相对偏差不超过0.30‰。

称取约10g均匀样品于50mL离心管中，加入10mL蒸馏水和1.2g氢氧化钙，用涡旋混合器均质2 min后于90℃水浴中恒温3min，以3 000r／min离心5min，将上层清液转移至另一50mL离心管中。上清液用0.1mol／L硫酸调节pH至5.0，于4℃过夜沉淀后取出，用5μL微量进样器移取1μL上清液至锡杯中，用于酱油中糖的δ13C值测定，每个样品平行测定2次，取平均值，相对偏差不超过0.30‰。

在第一次离心所得的沉淀物中加入40mL蒸馏水，用涡旋混合器均质2min，充分洗涤，再离心5min后弃去上层清液，如此反复离心3次。获得的沉淀物置于恒温干燥箱中，于75℃烘干后，移取约1mg粉末至锡杯中，用于测定酱油中氨基酸的δ13C值，每个样品平行测定2次，取平均值，相对偏差不超过0.30‰。

1.3 实验条件

1.3.1 元素分析仪条件 氧化管温度：950℃；还原管温度：680℃；气相色谱柱温箱温度：50℃；载气（He）流速：120mL／min；氧气流速：250mL／min；氧化时间：3s。

1.3.2 同位素质谱仪条件 离子化方式：电子轰击离子化（EI）；氦气压力：100kPa；二氧化碳压力：100kPa；离子源电压：2.97kV；真空度：1.8×10-4Pa。

2 结果与讨论

本实验样品的δ13C值由Isodat 3.0软件直接给出。其中，δ13C值的计算是基于一个国际标准物质Vienna peedee belemnite standard （VPDB）［17］，计算公式为：

δ13C＝（Rsample-RVPDB）／RVPDB×1 000（1）式中，Rsample为样品的13C与12C的同位素比值，RVPDB＝0.011 237 2。

在测定样品时，每间隔10个样品需测定一次碳同位素标准物质，进行系统稳定性评价，该标准物质所测得的δ13C值应与证书标明值的偏差在0.30‰范围内。

同时，为评估整个实验的重现性，选取一个酿造酱油样本，连续40天检测该样本的酱油δ13C值、糖δ13C值和氨基酸δ13C值，所得结果的相对标准偏差分别为1.27%、0.95%和1.42%，可见本方法的数据重现性较好，能满足检测酱油及其组分δ13C值的要求。

2.1 酱油中氨基酸和糖分离过程的优化

从酿造酱油的营养成分表中可以看出其主要成分为糖和氨基酸，测定糖和氨基酸的δ13C值需要将两者从酱油中分离。

本实验通过加入氢氧化钙与氨基酸反应形成沉淀后离心，得到的上清液为糖，沉淀为氨基酸钙盐，从而达到两者分离的目的。若加入氢氧化钙的量不足，氨基酸不能完全沉淀，则上清液中仍有少量氨基酸，影响糖的δ13C值；若加入氢氧化钙的量过多，将造成试剂浪费。因此氢氧化钙的加入量成为需要优化的因素。实验选取一个酿造酱油样本，在10g均匀样品中加入10mL蒸馏水，然后分别加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0g氢氧化钙，测定上清液和沉淀的δ13C值，结果列于表1。从表1可以看出，在不同加入量情况下，氨基酸δ13C值的变化很小，这从另一个角度说明了方法的重复性较好，但是在氢氧化钙加入量为0.4g和0.8g时，糖的δ13C值相对于其他3个加入量明显偏负，这是由于氨基酸沉淀未完全，上清液中含有δ13C值偏负的氨基酸，从加入量为1.2g开始，糖的δ13C值趋于稳定，表明氨基酸已沉淀完全。因此选取氢氧化钙的加入量为1.2g。

表1 不同氢氧化钙加入量下的糖和氨基酸的δ13C值Table 1 δ13C values of sugar and amino acidwith different amount of calcium hydroxide

由于酱油中含有一定量的糖，第一次离心后会有一些糖附着在沉淀上，本实验采用40mL水洗涤和3次离心的方法去除糖对氨基酸δ13C值测定的干扰。为了验证该方法的效果，在一个标签为含糖量10%的酿造酱油样本中，再加入适量的蔗糖（δ13C值为-12.14‰），配制成含糖量为20%和30%的样本，3个样本按照1.2节进行样品前处理并测定氨基酸δ13C值。原样本、含糖20%样本、含糖30%样本的氨基酸δ13C值分别为-24.86‰、-25.09‰和-24.94‰。结果表明，尽管加入更多不同含量的糖溶液，并且蔗糖的δ13C值与自身氨基酸的δ13C值相差悬殊，但在该前处理条件下得到的沉淀中并无糖残留，说明本方法能够有效去除沉淀物上残留的糖。

2.2 EA-IRMS法检测酱油和AHPS

本工作采用EA-IRMS法对86个纯正酿造酱油样品进行检测，分别测定酱油δ13C值、酱油中糖δ13C值和氨基酸δ13C值。结果表明：酱油δ13C值在-25.69‰～-18.45‰范围内，均值为-23.66‰；酱油中糖δ13C值在-24.81‰～-16.63‰范围内，均值为-22.15‰；酱油中氨基酸δ13C值在-25.88‰～-21.59‰范围内，均值为-24.57‰。3种δ13C值中，氨基酸δ13C值相对于其他两个明显偏负，并且仅有氨基酸δ13C值大致呈正态分布，示于图1。

同样，采用EA-IRMS法对58个酱油样本进行检测。结果表明：这些酱油的δ13C值在-25.59‰～-12.93‰范围内，均值为-22.41‰；糖的δ13C值在-25.14‰～-13.75‰范围内，均值为-21.89‰；氨基酸的δ13C值在-25.83‰～-12.22‰范围内，均值为-22.49‰，分布情况示于图2。

图1 酿造酱油、酱油中糖和氨基酸的δ13C值分布图Fig.1 δ13C values distribution of the authentic FSS，sugar and amino acid in FSS

图2 日常检测样本酱油、酱油中糖和氨基酸的δ13C值分布图Fig.2 δ13C values distribution of soy sauce，sugar and amino acid for daily samples

另外，对15个酸水解调味液样品进行EAIRMS检测。结果表明：AHPS的δ13C值在-24.58‰～-12.58‰范围内，均值为-17.51‰；糖的δ13C值在-24.82‰～-12.33‰范围内，均值为-17.28‰；氨基酸的δ13C值在-23.92‰～-12.79‰范围内，均值为-17.71‰。在某些调味液中未提取出糖，可能是水解原料中并无淀粉。

2.3 酱油的掺假鉴别应用

由于酱油的组分较为复杂，本工作研究了酱油中其他微量组分对氨基酸δ13C值测定的影响。除了主要原料（水、食用盐、大豆和淀粉类谷物），酿造酱油配料表所列的配料包括：防腐剂类（山梨酸钾、苯甲酸钠）、甜味剂类（三氯蔗糖）、增鲜剂类（谷氨酸钠、5’-呈味核苷酸二钠）、色素类（焦糖色）。从这些组分的分子结构考虑，与氢氧化钙一起沉淀的组分可能有山梨酸钾、苯甲酸钠、谷氨酸钠、5’-呈味核苷酸二钠。

采用高效液相色谱法［25］测定了86个酿造酱油中山梨酸、苯甲酸含量，两种组分含量分别在未检出～500mg／kg和未检出～450mg／kg范围内，符合GB 2760-2011［26］中1g／kg的限量要求；而86个酿造酱油的标签表明，氨基酸含量在60～127g／kg范围内，从含量角度考虑，即使添加的山梨酸钾、苯甲酸钠为碳-4来源产物，对氨基酸δ13C值测定的影响也可忽略。林耀盛等［27］研究的30种酱油中5’-呈味核苷酸二钠的含量在28.6～200mg／kg范围内，同样从含量角度考虑，认为可忽略该类组分对氨基酸δ13C值测定的影响。另外，本研究测定了23个谷氨酸钠市售样本的δ13C值，结果在-25.50‰～-24.00‰范围内，为碳-3代谢产物，对氨基酸δ13C值测定同样没有影响。

从86个FSS的δ13C值数据中可以看出，某些酱油和其中糖的δ13C值已显示了碳-4代谢产物的特征，造成这种现象的原因在于酱油生产企业加入了白砂糖，而白砂糖中的甘蔗糖正是碳-4代谢产物，甘蔗糖与酱油自身的碳-3植物糖一起贡献了最终的糖δ13C值。由于各个厂家加入的甘蔗糖含量不一，最终导致酱油和糖的δ13C值不呈正态分布。

由于加入的白砂糖并不会影响氨基酸的δ13C值，而FSS的氨基酸来源于碳-3植物大豆，应体现碳-3代谢产物的δ13C值特征。基于以上原因，本研究选取氨基酸δ13C值作为鉴别FSS中是否掺入碳-4来源AHPS的指标。86个FSS中氨基酸δ13C值在-25.88‰～-21.59‰范围内，均值为-24.57‰，较好的体现了碳-3代谢产物特征。基于以上论述，提出FSS应满足氨基酸δ13C值不大于-21.50‰。

依据此要求，59个日常检测样本中有15个样本的氨基酸δ13C值大于-21.50‰，初步认为这些样本中掺入了碳-4来源的AHPS。为了进一步确证这15个样本为掺假样本，采用气相色谱-同位素比值质谱法对其中乙酰丙酸的情况进行了研究，测定采用的气相色谱条件参照SB／T 10417—2007［4］。结果表明，这15个样本中乙酰丙酸的δ13C值在-10.50‰～-14.50‰范围内，显示了碳-4代谢产物的特征，从而确证了这些样本的确掺入了碳-4来源的AHPS。以其中一个掺假酱油为例，样本的整体δ13C值为-22.32‰，仅从这个碳-3特征的数值无法有效鉴别为掺假样本，但其氨基酸δ13C值为-20.66‰，由此可判定该样本为掺假酱油，这从另一个角度证明了采用氨基酸δ13C值作为判定指标更为有效。

15个AHPS样本中有11个被确认不符合FSS的δ13C值要求，其中6个水解动物蛋白调味液全部不符合要求，9个水解植物蛋白调味液有5个样本不符合要求，其余符合要求的4个样本应该是水解了碳-3来源的植物蛋白最终产物。

为了进一步验证该方法的有效性，选取一个酿造酱油与AHPS按照不同的比例混合，测定样本中氨基酸δ13C值，结果示于图3。从图3可以看出，当掺入AHPS达到15%及以上时，即被鉴别为掺假酱油。

图3 掺入不同比例AHPS的酱油δ13C值变化图Fig.3 Plot ofδ13C value of amino acid vs percentage of AHPS addition

3 结论

本实验利用元素分析-碳同位素比值质谱法对国内各地区、各种类共86个酱油样本的δ13C值进行了研究，初步建立了纯正酿造酱油的δ13C值数据库，提出鉴别酱油掺入酸水解蛋白调味液的方法。在59个样本中鉴定出15个样本掺入了外源性的酸水解蛋白调味液。因此，该方法能够评估酱油的品质，可以作为酿造酱油品质保障和掺假鉴定的有效手段。

同时，该方法还存在一些不足之处，如只能鉴别碳-4来源的酸水解蛋白调味液掺假，对于碳-3来源的调味液掺假无能无力。今后，在工作中可考虑结合液相色谱-稳定同位素技术测定其中各种氨基酸的δ13C值，基于酿造酱油和酸水解蛋白调味液在氨基酸组成和δ13C值差异的角度提出更为全面有效的鉴别方法。

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Detection of Fermented Soy Sauce Adulteration Using Elemental Analyzer-Carbon Isotope Ratio Mass Spectrometry

TAN Meng-ru1，LIN Hong2，SHEN Chong-yu2，WU Bin2，ZHANG Rui2，DING Tao2，FEI Xiao-qing2，YANG Gong-jun1
（1.College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing211198，China；
2.Laboratory of Food，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China）

In order to strengthen the supervision of the quality of fermented soy sauce （FSS），a method for FSS adulteration identification was established using elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometry（EA-IRMS）.Base on theδ13C values of 86 authentic FSS samples from different production areas，theδ13C value limit for authentic FSS was proposed：theδ13C value of the amino acid in FSS should be lower than or equal to-21.5‰.Based on the above criteria，15soy sauce samples are confirmed adultera-ted with acid hydrolyzed protein seasoning（AHPS）in 58commercial soy sauce samples.As a conclusion，the EA-IRMS method，as a tool of quality assuance and adulteration identification，can effectively assess the quality of fermented soy sauce.

fermented soy sauce；elemental analyzer-carbon isotope ratio mass spectrometry（EA-IRMS）；adulteration；acid hydrolyzed protein seasoning

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0334-07

10.7538／zpxb.youxian.2015.0016

2014-07-21；

修回日期：2014-11-05

江苏出入境检验检疫局科技计划项目（2013KJ41）；国家自然科学基金（21275162）；“青蓝工程”项目资助

谭梦茹（1992—），女（汉族），内蒙古根河人，研究生，药物分析专业。E-mail：tiantan1289＠sina.com

费晓庆（1983—），男（汉族），江苏如东人，工程师，从事食品分析与食品掺假鉴别研究。E-mail：dii01208＠163.com杨功俊（1969—），男（汉族），江苏如东人，副教授，从事电化学分析及现代药物分析研究。E-mail：gjyang＠cpu.edu.cn

时间：2015-05-26；

网络出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0921.009.html