奶牛副结核病的血清学调查与防控措施

瞿慧方桂明顾晓李东尧刘淡宁王恒安

（1，上海交通大学农业与生物学院 200240；2，上海市奉贤区动物疫病预防控制中心 201499）

奶牛副结核病的血清学调查与防控措施

瞿慧1.2方桂明2顾晓2李东尧2刘淡宁2王恒安1*

（1，上海交通大学农业与生物学院 200240；2，上海市奉贤区动物疫病预防控制中心 201499）

副结核病是由副结核分枝杆菌引起的以牛、羊等反刍兽的慢性消化道疾病。以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱襞为特征。本文采用副结核酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法进行了调查分析。结果表明：在430份样品中，副结核抗体阴性414份，副结核抗体阳性16份，阳性率3.7%。本次副结核病的血清学调查的数据与分析为本病防控提供了科学依据。

奶牛；副结核病；血清学调查；防控；奉贤区

副结核病 （Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌引起的以牛、羊等反刍兽的慢性消化道疾病，属于禽分枝杆菌副结核亚种，是一种细长杆菌。Johne于1895年首先发现本病，故又称为约内氏病 （Johne病）。以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠粘膜增厚并形成皱襞为特征。通常动物在出生的第一年通过采食被感染动物粪便污染的饲料感染本病，副结核的感染是一个很漫长的过程，潜伏期通常为3～5年，最早4个月的犊牛就可以表现出临床症状，长的可达15年[1]。OIE将其列为B类疫病。

本病广泛流行于世界各国，如美国、澳大利亚、日本、英国等国家，给全球范围内的畜牧业造成了很大的经济损失。有报道副结核病感染会造成整个牛群每头奶牛超过200美元的损失，损失主要是产奶量的降低。副结核病对整个奶牛产业的损失估计为每年2～2.5亿美元。本病没有有效的治疗方法，感染动物最后会因为此病死亡，死亡率通常在3～10%。根除本病的唯一方法就是检出、隔离或者淘汰[2]。我国最早发现牛副结核病是在1955年内蒙古自治区的一个牧场，此后黑龙江、贵州、河北等多个地区相继报告此病，几乎遍及我国大部分北方区域。随着我国国民生活水平的不断提高，对奶制品的需求也不断随之增长，急需大量高产、优质奶牛，造成全国甚至世界奶牛大流通，为本病的传播提供了便捷。上海市奉贤区是上海市政府确定的适度养殖区，目前辖区内有规模化奶 （种）牛场19家，总存栏量达11000多头，是上海的奶牛养殖大区。结合近几年该区奶牛结核病的防控工作，我们分析结核病检测结果得出，在牛结核的检疫中存在禽结核或副结核的干扰。同时，该区奶牛养殖场存在不同比例以奶牛腹泻、消瘦为主要症状的病例发生。为进一步掌握该区奶牛副结核病的流行情况，我们开展了本次奶牛副结核病的调查，并对结果进行分析，旨为本区奶牛副结核病防控提供科学依据，供广大同行参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

对奉贤区19家奶牛场进行血样品采集，每头牛尾根静脉无菌采血5ml，每家牛场根据饲养规模大小采集样品20或30份，其中育成牛10或15份，成乳牛10或15份，共采集血样品430份。每场编号前10或15份为育成牛样品，后10或15份为成乳牛样品。在成乳牛样品中，每场最后5份样品有目的性挑选有腹泻、消瘦、被毛长或者不发情症状的成乳牛，其余样品为随机采集。所有样品经离心后取上清液移至离心管内，编号后放入冰箱内-20℃保存，待检。

1.2 牛副结核抗体酶联免疫吸附试验 （ELISA）

1.2.1 实验原理

用副结核抗原包被微量反应板。为了结合非特异性的抗体，样品首先与草分枝杆菌提取物预孵育。将预孵育的样品加入抗原包被的反应板进行孵育。检测样品在包被孔内孵育后，副结核特异性抗体会形成抗原抗体免疫复合物。将未结合的材料洗去，加入抗反刍动物酶标抗体，它会与抗原抗体复合物结合。洗掉未结合的酶标抗体，加入底物液。在酶的作用下，底物被氧化成蓝色化合物。加入终止液后，又变成黄色。随后的颜色深浅与检测样品中存在的副结核抗体成正比。诊断相关结果通过样品的光密度值与阳性对照光密度的平均值相比较而得出。

1.2.2 判定标准

阴性：S/P%≤45%，判定为 “—”。

可疑：S/P%大于45%且小于55%，判定为 “±”。

阳性：S/P%≥55%，判定为 “+”。

1.2.3 试剂盒生产单位

北京爱德士元亨生物科技有限公司，批号：4109F。

2 结果与分析

2.1 奶牛副结核病血清学调查结果

本次调查共收集19家规模化奶牛场样品430份，根据检测判定标准，在430份样品中，副结核抗体判定为阴性的有414份，副结核抗体判定为阳性的有16份，阳性率3.7%。

检测结果显示，在本次调查中有11家奶牛场检测到了阳性样品，占牛场数的57.80% （详见表1）。

2.2 成乳牛副结核病血清学调查结果

2.2.1 有症状组成乳牛调查结果分析

本次采样过程中，有针对性的从每家奶牛场中选择5头有腹泻、消瘦、被毛长或者不发情等症状的奶牛作为检测对象，共计95头来检测是否感染牛副结核病。经过实验室检测，在这95份样品中，牛副结核抗体判定为阴性的有88份，牛副结核抗体判定为阳性的有7份，阳性率为7.4%。其结果表明在有腹泻、消瘦等临床症状的奶牛当中有较高一部分为牛副结核病感染，或者与其他疾病混合感染 （详见表2）。

2.2.2 随机组成乳牛血清学调查结果分析

本次调查除针对性的采集上述95份成乳牛样品，其余120份样品为随机采集。经过实验室检测，牛副结核病抗体判定为阴性的有117份，副结核病抗体判定为阳性的有3份，副结核病抗体阳性率为2.5%。说明存在副结核病的隐性或慢性感染 （详见表2）。

2.3 育成牛副结核病血清学调查结果

本次调查共采集育成牛样品215份，经过实验室检测，牛副结核病抗体判定为阴性的有209份，牛副结核病抗体判定为阳性的有6份，阳性率为2.8%；其中有5个牛场存在育成牛副结核抗体阳性，占牛场数的26.3% （见表1）。

表1 牛副结核抗体检测结果 （单位：头、%）

3 讨论

（1）王永康等[3]对上海的1250份奶牛待检血清进行了副结核病ELISA检测，共检出阳性9份，阳性率0.72%。14年后，我们通过对该区奶牛副结核病的调查，ELISA检测副结核病阳性率3.7%，说明该区奶牛副结核发病率有所上升，这与该区部分牧场反映有腹泻、消瘦等症状病牛存在的临床调查情况一致。也可能与近几年奶牛交易大流通广等因素有关，应引起高度重视。

表2 成乳牛抗体检测结果 （单位：头、%）

（2）由于病牛往往在感染后期才出现临床症状，因此药物治疗常无效。尽管在体外试验中，副结核分枝杆菌对多种抗结核类药物敏感，但用于治疗往往效果不明显，或者仅能缓解症状，不能抑制其向外排菌。

（3）对于牛结核检疫中检出的可疑牛，常常在复检时，给牛同时注射牛型和禽型两种菌素作鉴别诊断，这已是当前奶牛结核检疫中所普遍采用的方法。2013年，我们在对全区奶牛结核检疫中检出的670头可疑牛，采用牛型与禽型比较变态反应试验进行复检，结果有10头综合判断为禽结核阳性牛。由于禽结核菌与副结核菌有较多的类属抗原，所以各国也会采用禽结核菌素来检疫副结核病。王铁等[4]（1993）采用副结核弱毒苗对40头犊牛出生一周内皮下接种，7d后用禽型结核菌素进行检疫，全部为阳性。说明该区奶牛结核病复检鉴别诊断出的禽结核有较大比例是副结核病，应根据牛只健康情况给予隔离或者淘汰。

（4）预防本病重在加强饲养管理，特别是对犊牛更应注意给以足够的营养，以增强其抗病力。不要从疫区引进牛只，如已引进，则必须进行检测，确诊健康时，方可混群。

（5）被病牛污染过的牛舍、走道、饲槽、用具及运动场等，要用生石灰、来苏儿、苛性钠、漂白粉、石炭酸等消毒液进行喷雾、浸泡或冲洗。粪便应堆积高温发酵后作肥料用。

（6）关于本病的人工免疫，目前尚有争论。据报道，我国有的单位从英国引进副结核弱毒株，研制出副结核弱毒疫苗，在有副结核 （无结核病）的牛场试验，免疫期可达48个月。我国吉林省兽医科学研究所用副结核灭活苗对污染牛群新生犊牛在7日内接种，同时采取以下综合措施：①犊牛生后立即与母牛分开，人工饲喂牛乳。②犊牛所吃的牛奶经过消毒。③犊牛专人饲养，舍内经常清扫并消毒。④对成年牛每年定期检疫，检出阳性牛应隔离饲养，一旦发现开放牛立刻扑杀，并对其可能污染的场所、用具进行彻底消毒。他们用这样方法经7年时间使某个牛场的副结核检出率由原来的 8.83%降至0.34%[4]。

[1]Chiodini R.J,et al.The Cornell,1984,74（3）.

[2]陆承平主编.兽医微生物学（第三版）,中国农业出版社,2001:331-339.

[3]王永康,等.上海市奶牛副结核病的血清学调查[J].上海畜牧兽医通讯,2000（2）:24.

[4]王铁,等.牛接种副结核病弱毒苗对禽型结核菌素变态反应的影响[J].中国兽医科技,1993（5）:20-21.

*为通讯作者。