一株猪II型链球菌分离鉴定及生物特性研究

刘瑞雪 王鲁敏 黄倩倩

（山东省即墨市畜牧兽医局 266200）

一株猪II型链球菌分离鉴定及生物特性研究

刘瑞雪 王鲁敏 黄倩倩

（山东省即墨市畜牧兽医局 266200）

从即墨某猪场发病猪的关节液中分离出一株疑似链球菌，通过菌落形态、生化试验、药敏试验及PCR检测对分离的疑似猪链球菌进行初步研究。经菌落形态学和生化鉴定为猪链球菌，药敏试验结果表明该菌株对氧氟沙星、环丙沙星中度敏感，对先锋霉素V、复合磺胺、强力霉素敏感。通过对分离菌株进行PCR鉴定及分型，确认该菌株为猪II型链球菌。

猪；链球菌；药敏试验；生化试验；PCR

当前，猪链球菌病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重要的人兽共患传染病。链球菌可引起猪的多种疾病，主要以败血症、脑膜炎、关节炎、淋巴结炎为主要发病特征。该病分布广泛，发病率高，特别是急性败血症和脑膜炎型链球菌病，其病死率较高，对我国养猪业造成较大危害，因此愈来愈引起人们的高度关注[1,2,3]。近年来，随着分子生物学技术的发展，PCR方法已经广泛应用于猪链球菌血清型的检测，使得该病的检测越来越简便和灵敏。

1 材料

1.1 病料来源

病料来源于即墨市某养猪场病死猪，无菌采取发病猪心血、肝、淋巴结、脑和关节液保存，以备分离菌株。

1.2 培养基

将TSA胰蛋白胨大豆琼脂、TSB胰蛋白胨大豆肉汤培养基，购自英国OXOID公司，按照产品说明书配制，经高压蒸汽灭菌后加入新生牛血清和NAD溶液，使其浓度分别为5%和0.02%。

1.3 生化试剂

生化管为：6.5%高盐肉汤、甘露醇、海藻糖、山梨醇、乳糖、菊糖、马尿酸钠、七叶苷和明胶，购自杭州天和微生物公司。

1.4 药敏纸片

青霉素G、阿莫西林、链霉素、先锋霉素V、氧氟沙星、卡那霉素、氯霉素、新霉素、庆大霉素、红霉素、强力霉素、环丙沙星、复合磺胺13种药敏纸片购自杭州天和微生物公司。

2 方法

2.1 菌株的分离

将采集的病料划线接种于含有5%犊牛血清的TSA平皿上，37℃培养12～24h后观察，挑取直径0.1～1.0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落进行革兰氏染色。革兰氏染色阳性、成对或有链状排列的球形细菌为可疑菌落，对其传代纯化。

2.2 生化试验

对于纯化好的可疑菌落按使用说明做以下生化实验： 6.5%高盐肉汤、甘露醇、海藻糖、山梨醇、乳糖、菊糖、马尿酸钠、七叶苷和明胶。符合链球菌生化标准的菌株判为链球菌。

2.3 药敏试验

按标准纸片琼脂扩散法 （K-B法）操作。

2.4 PCR鉴定

2.4.1 本试验所用PCR引物见附表。

2.4.2 PCR模板、反应体系和反应条件

按试剂盒说明书提取链球菌基因组为PCR模板。PCR反应体系和反应条件按参考文献进行。

3 结果

3.1 菌落形态

通过菌体形态、革兰氏染色，初步判定从即墨某猪场的发病猪的关节液中分离出一株疑似猪源链球菌，命名为SS1（见附图）。

附图 疑似猪链球菌的形态图

附表 本试验所用PCR引物

3.2 生化鉴定

该疑似链球菌SS1株不发酵甘露醇、山梨醇、海藻糖、七叶苷、菊糖、乳糖，产酸不产气，无运动性，符合猪链球菌的生化特性。

3.3 药敏试验结果

该疑似链球菌SS1株对青霉素G、阿莫西林、链霉素、卡那霉素、氯霉素、新霉素、庆大霉素、红霉素耐药；对氧氟沙星、环丙沙星中度敏感，对先锋霉素V、复合磺胺、强力霉素敏感。

3.4 PCR鉴定

用猪链球菌通用引物进一步做PCR鉴定，确认SS1株为猪链球菌；又将其进行猪II型链球菌通用引物的鉴定，结果表明该菌株的序列与NCBI上发布的猪II型链球菌基因序列的同源性均为98%。

4 讨论

由于链球菌广泛存在于正常猪的呼吸道、扁桃体等器官和组织中[1.3]。药敏试验结果表明，所分离的先锋霉素V、复合磺胺、强力霉素，而对大多数药物如青霉素G、阿莫西林、链霉素、卡那霉素、氯霉素、新霉素、庆大霉素、红霉素均产生较高的抗药性。因此，临床上可把先锋霉素V和环丙沙星作为治疗猪链球菌病的首选药物。

在欧洲导致猪发生猪链球菌病以R群的II型猪链球菌为主，其次是1型、9型、7型和其它型[3,4]。而我国，以前以C群的马链球菌兽疫亚种为主，近年来也常有猪链球菌II型的报道，该研究中猪II型链球菌在山东省即墨某猪场发现，表明该型链球菌已在山东流行，但是该菌株并未对该猪场造成严重的经济损失，表明该分离菌株毒力较弱。

本研究对该菌株进行了初步研究，有利于该猪场猪链球菌病的防控，间接促进该猪场的经济效益。

[1]黄毓茂,黄引贤,等.II型猪链球菌的血清学鉴定[J].中国兽医学报,1995,15(1):63-65.

[2] 姚火春,陈国强,陆承平,等.猪链球菌1998分离株病原特性鉴定[J].南京农业大学学报.1999,22（2）:67-70.

[3]Yu H,Jing H,Chen Z,et al.Huma Streptococcus suis outbreak,Siehuan China[J].Emerg Infect Dis,2006,12（6）:914-920.

[4]Smith H E,de Vries R,van Slot R.The cpslocus of Streptococcus suis serotype 2:genetic determinant for the synthesis of sialic acid[J].Microb Pathog,2000,29:127-134.