合欢皮总皂苷对小鼠神经系统的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表达的影响

2015-12-08 03:00蔡维维邱丽颖
中成药 2015年11期
关键词:合欢皮总皂苷小剂量

杜 斌, 蔡维维, 冯 磊, 邱丽颖

(江南大学无锡医学院,江苏无锡214122)

合欢皮总皂苷对小鼠神经系统的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表达的影响

杜 斌, 蔡维维, 冯 磊, 邱丽颖*

(江南大学无锡医学院,江苏无锡214122)

目的 通过观察合欢皮总皂苷对小鼠神经系统的SOD、GSH-PX活性及COX-2、CaN表达的影响,研究其毒性机制。方法 实验分为正常对照组、合欢皮总皂苷小剂量致毒组 (7.5 mg/kg)及合欢皮总皂苷大剂量致毒组 (750 mg/kg),一次性灌胃给药,观察给药前及给药14 d时小鼠自主活动次数,比色法检测脑组织超氧化物歧化酶 (SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)活性,链霉亲和素-生物素复合物 (SABC)免疫组化试剂盒检测环氧化酶-2(COX-2)、钙调神经磷酸酶 (CaN)的表达。结果 合欢皮总皂苷致毒剂量可降低小鼠自主活动次数;与正常对照组比较,给药组脑组织中CaN表达降低;COX-2表达增高,有显著差异性,与合欢皮总皂苷小剂量致毒组比较,合欢皮总皂苷大剂量致毒组脑组织中CaN表达降低,COX-2表达增高,有显著差异性。与正常对照组比较,给药组脑组织中SOD和GSH-PX活性均降低,有显著差异性;与合欢皮总皂苷小剂量致毒组比较,合欢皮总皂苷大剂量致毒组脑组织中SOD活性降低,GSH-PX活性增高,但无差异性。结论 合欢皮总皂苷致毒剂量对神经系统有毒性作用,可能与总皂苷降低SOD、GSH-PX活性,同时增高COX-2表达、降低CaN表达有关。

合欢皮总皂苷;神经毒性;小鼠

合欢皮为豆科植物合欢(Albizia julibrissin Durazz)的干燥茎皮,合欢皮中含有黄酮、三萜、多糖、木脂素、鞣质、生物碱、甾醇、脂肪酸甘油酯、吡啶衍生物等多种化学成分。2000年版 《中华人民共和国药典》一部收载合欢皮具有解郁安神,活血消肿的功能,说明安心神、解忧郁为合欢皮的主要功效。临床方剂合欢汤有解郁作用,大致相当于兴奋大脑皮层。用于心神不安,忧郁失眠,肺痈疮肿,跌扑伤痛等症[1]。文献报道及本实验室研究发现合欢皮总皂苷有显著抗肿瘤新生血管的作用[2-3],同时发现一定剂量合欢皮总皂苷对肾脏、肺脏、肝脏、生殖系统、胃肠道等有一定的毒性[4-8]。为了促进临床使用,需进一步探讨合欢皮总皂苷对神经系统的作用机制及毒性。

1 实验与仪器

1.1 实验动物 清洁级昆明种小鼠,雌雄各半,体质量20 g左右。上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,动物合格证号为沪SXK2012-0002。

1.2 药物和试剂 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)(南京建成生物工程研究所,批号20130530);谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)(南京建成生物工程研究,批号20130425);考马斯亮蓝 (南京建成生物工程研究所,批号20130428);细胞凋亡及环氧化酶(Cyclooxygenase,COX)测定试剂盒(武汉博士德生物有限公司,批号分别为13CM400,195841);DAB显色液A、B(批号P0203-1、P0203-2,碧云天生物技术研究所);其余试剂为国产分析纯。合欢皮 (安徽颐生堂中药饮片有限公司,批号120320),70%乙醇加热提取2次,提取液浓缩至无乙醇。通过D101型大孔树脂柱吸附后依次用水、35%和80%乙醇进行梯度洗脱,收集80%洗脱组分,冷冻干燥,所得冻干粉即为实验用样品。

1.3 仪器 TG16A-WS台式离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);TS-8型漩涡混匀器 (江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司);DK-8B型电热恒温水浴槽 (上海精宏实验设备有限公司);ME204E电子天平 (梅特勒-托利多仪器 [上海]有限公司);ELX800全自动酶标仪 (美国伯腾仪器有限公司);5804R多功能台式离心机 (德国艾本德公司);80i正置荧光显微镜 (日本尼康公司);ZZ-6小鼠自主活动仪 (成都泰盟软件有限公司)。

2 方法

3 结果

3.1 合欢皮总皂苷对小鼠30 min自主活动的影响 与正常对照组比较,合欢皮总皂苷小剂量致毒组及大剂量致毒组,小鼠30 min站立和活动次数显著降低。与合欢皮总皂苷小剂量致毒组比较,大剂量致毒组小鼠30 min站立和活动次数显著降低。与给药前比较,合欢皮总皂苷小剂量致毒组及大剂量致毒组,小鼠30 m in站立和活动次数显著降低 (表1)。总皂苷小剂量致毒组(7.5mg/kg)及合欢皮总皂苷大剂量致毒组 (750 mg/kg),每组10只,雌雄各半。给药剂量参照本实验室急性毒理学研究所得的最小致毒量和最小致死量确定。禁食4 h后一次性灌胃给药,对照组给予等体积正常。

2.2 小鼠自主活动观察 给药前和给药14 d后,成都泰盟有限公司小鼠自主活动测试仪测试小鼠30 min活动和站立次数。

2.3 脑组织SOD和GSH-PX的测定 取脑组织相同部位的一小块组织,用冰盐水漂洗,吸水纸吸干,称重,放入10 mL离心管中;加入适量的冷生理水,2 000 r/min匀浆10 s,间歇30 s,反复3次制成10%的组织匀浆;使用冷冻离心机,4℃,3 500 r/min离心10 m in,取上清液测定脑组织中SOD和GSH-PX的活性。各指标测定按照试剂盒说明书进行操作。以考马斯亮蓝法测定蛋白的量。

2.4 SABC免疫组化试剂盒检测COX-2、CaN阳性细胞的表达 常规脱蜡至水,根据SABC免疫组化试剂盒说明,电炉煮沸法进行抗原修复,3%H2O2灭活内源性酶,切片于0.01 M枸橼酸盐缓冲液 (pH 6.0),滴加正常山羊血清封闭液(50μL/片)、CaN或COX-2抗体、生物素化山羊抗小鼠抗体(50μL/片)及SABC(50μL/片),DAB显色剂,光镜下控制显色时间,待细胞核呈棕黄色时,终止反应;再用苏木精复染,逆梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察。

2.5 COX-2及CaN阳性细胞表达计数 高倍镜下观察,CaN的阳性细胞表达即核内呈棕黄色。COX-2阳性细胞表达即胞浆呈棕色颗粒。每张切片随机选10个非重叠400高倍镜视野,计数COX-2、CaN阳性细胞数。

2.6 统计学处理 SPSS 17.0统计软件进行数据处理,进行单因素方差分析,组间采用t检验,实验数据以

表1 合欢皮总皂苷对小鼠30m in自主活动的影响

表1 合欢皮总皂苷对小鼠30m in自主活动的影响

注:与正常对照组比较,**P<0.01;与合欢皮总皂苷小剂量组比较,##P<0.01;与同组给药前比较,△△P<0.01

组别 剂量/(mg.kg-1) 给药前 给药后活动次数/次 站立次数/次 活动次数/次 站立次数/次32.60±8.33 92.40±13.97 33.20±9.93 88.10±7.48合欢皮总皂苷小剂量组 7.5 34.20±11.06 95.39±10.25 20.42±5.76**△△ 55.46±8.18**△△合欢皮总皂苷大剂量组 750 29.35±7.75 95.12±11.65 14.09±6.60**##△△ 45.83±7.77**##△△正常对照组0

3.2 合欢皮总皂苷对脑组织SOD和GSH-PX的影响 与正常对照组比较,合欢皮总皂苷小剂量致毒组及大剂量致毒组脑组织的SOD和GSH-PX活性均显著降低。与合欢皮总皂苷小剂量致毒组比较,大剂量致毒组脑组织SOD活性降

低,GSH-PX活性增高,但无统计学意义 (表2)。3.3 合欢皮总皂苷对脑COX-2及CaN的影响 COX-2在正常脑组织中少有表达。与正常对照组比较,给药组脑组织中COX-2表达明显增高,有显著差异性。与合欢皮总皂苷小剂量致毒组比较,合欢皮总皂苷大剂量致毒组的COX-2表达明显增高,有显著差异性 (图1、表3)。

表2 合欢皮总皂苷对脑组织SOD、GSH-PX活性的影响

表2 合欢皮总皂苷对脑组织SOD、GSH-PX活性的影响

注:与正常对照组比较,**P<0.01;与合欢皮总皂苷小剂量组比较,##P>0.05

组别 剂量/(mg.kg-1)SOD/(U.gprot-1)GSH-PX/(U.mL-1)0 357.29±28.7 123.65±33.6合欢皮总皂苷小剂量组 7.5 162.92±29.95** 31.32±3.63**合欢皮总皂苷大剂量组 750 158.33±30.23** 37.32±5.88正常对照组**

与正常对照组比较,给药组脑组织中CaN表达显著降低,有显著差异性。与合欢皮总皂苷小剂量致毒组比较,合欢皮总皂苷大剂量致毒组的脑组织中CaN表达显著降低,有显著差异性 (图1、表3)。

图1 合欢皮总皂苷对小鼠脑COX-2及CaN表达的影响(×400)

表3 合欢皮总皂苷对脑细胞凋亡及CaN表达的影响s,n=10)

表3 合欢皮总皂苷对脑细胞凋亡及CaN表达的影响s,n=10)

注:与正常对照组比较,**P<0.01;与合欢皮总皂苷小剂量组比较,##P<0.01

组别 剂量/(mg.kg-1)COX-2/(个/视野)CaN/(个/视野)5.3±0.43 43.7±3.41合欢皮总皂苷小剂量组 7.5 27.6±5.25** 32.5±3.23**合欢皮总皂苷大剂量组 750 47.1±4.25**## 25.2±4.44**##正常对照组0

4 讨论

本实验室已经提取到合欢皮有效的抗肿瘤新生血管的组分和单体,但是毒性大安全范围较小[9-10]。合欢皮乙醇提取物具有良好的体内抗肿瘤活性,能明显抑制小鼠荷瘤生长速度,延长荷瘤鼠存活时间[11]。合欢皮总皂苷通过影响细胞周期,下调pAKT、pERK的表达量,从而抑制血管形成[12-14]。其抗肿瘤作用,由于药物剂量增大,神经系统的毒性也显现出来。我们在前期实验中报道合欢皮总皂苷7.5、75、750 mg/kg剂量组对呼吸系统及肾脏的毒性安全评价。本次实验结果显示合欢皮总皂苷小剂量致毒组及大剂量致毒组脑组织的SOD、GSH-PX活性和CaN表达均降低,脑组织中COX-2表达明显增加。过氧化损伤、自由基生成及细胞凋亡等可能为合欢皮总皂苷致神经毒性的机制。SOD是生物体内重要的抗氧化酶,SOD活性高低间接反映脑组织清除自由基的能力;GSH-PX是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶,对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要;CaN作为一种使底物脱磷酸化的蛋白磷酸酶,参与全身性应激反应引起的磷酸化反应,在维持重要器官磷酸化反应平衡中有重要意义。在过氧化损伤引起的细胞凋亡过程中,Bcl-2与COX参与了细胞凋亡的调控[4-5]。COX有两种同工酶COX-1和COX-2。COX-1为结构型被称为要素酶或管家酶,主要存在于血管、胃、肾等组织中,可产生的PG参与机体正常生理过程和保护功能;COX-2为诱导型,是经刺激迅速产生的诱导酶,即由各种损伤性化学、物理和生物因子诱导其产生,进而催化PGs合成参与炎症反应。COX的表达与细胞凋亡关系密切[15],本研究通过COX-2的表达观察合欢皮总皂苷对脑神经的影响。黄清松等[16]报道细胞内氧化还原与细胞凋亡有着密切的关系,本研究发现合欢皮总皂苷脑组织中SOD、GSH-PX活性与降低CaN的表达、增高COX-2的表达关系密切。本实验中,合欢皮总皂苷致毒剂量使脑组织COX-2表达明显

增多、CaN的表达明显减少,表明此毒性可能与降低脑组织中SOD、GSH-PX活性有关。与合欢皮小剂量组比较,合欢皮大剂量组脑组织中SOD、GSH-PX活性降低,但无统计学意义,而脑组织中CaN的表达减少,COX-2的表达增加,有显著差异性。这些指标的改变可能影响给药后小鼠30 m in站立和活动次数。上述变化有一定的剂量依赖关系,且与对照组比较有显著性差异。说明一定剂量的合欢皮总皂苷对可致小鼠神经毒性损伤,其损伤程度与合欢皮总皂苷的量呈正相关性,与陈小青等[17]报道一致。可判定合欢皮总皂苷类成分是合欢皮导致神经毒性的主要物质基础。

综上所述,合欢皮总皂苷对神经系统有一定毒性作用。本课题组在后续的研究中将选择阳性药物对照,加大对合欢皮的神经毒性组份及作用机制的研究。

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R285.5

B

1001-1528(2015)11-2514-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.040

2014-06-13

江苏省中医药管理局康缘中医药科技创新基金项目 (HZ0816KY)

杜 斌 (1983—),男,实验师,研究方向为药理学。Tel:13771560729,E-mail:dubin_41@126.com

*通信作者:邱丽颖 (1965—),女,教授,硕士生导师,研究方向为天然产物的开发和中药药理学。Tel:(0510)85327353,E-mail:qiulydoc@sina.com

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