大孔树脂纯化飞龙掌血总生物碱的工艺研究

2015-12-14 05:08刘思艺
中国民族民间医药 2015年15期
关键词:飞龙大孔恒温

刘思艺

广州中医药大学中药学院,广东 广州 510006

飞龙掌血又名见血飞,为芸香科飞龙掌血属植物飞龙掌血(Toddalia asiatica Lam)的干燥根或根皮,始载于《植物名实图考》,是贵州苗族习用药材。其味辛,微苦,性温;入肝、肺经。临床主要用于感冒、胃气痛、胸胁痛、风湿性关节炎、跌打损伤、月经不调、劳伤吐血、疮疖肿痛、毒蛇咬伤、外伤出血等[1-2]。现代研究表明其具有抗A 型流感病毒活性、抑制白色念珠菌、痢疾杆菌等细菌、抗心肌缺血等作用[3-6],研究前景广阔。总生物碱作为其一个有效部位群,占药材分离物的54.5%[7],有明显的抗炎、镇痛、止血活性[8-9],目前尚无优选飞龙掌血总生物碱富集纯化研究的报道。酸性染料比色法可对总有效部位进行含量测定,已有用于飞龙掌血提取物中总生物碱含量的测定[10]。本实验系统考察7 种大孔树脂对飞龙掌血总生物碱的吸附、解吸性能,并对筛选出的AB-8 树脂的纯化工艺做进一步的研究,确定了适宜的吸附、解吸的工艺条件。

1 材料与仪器

1.1 仪器 WFZ UV-2100 型紫外-可见分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);XS225A 型分析天平(瑞士普利赛斯公司);GKC21CR4 型可控硅恒温水浴锅(上海锦屏仪器仪表有限公司);MD200-2 型氮气吹扫仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.2 试剂与材料 柠檬酸固体、溴百里香草酚蓝、十二水磷酸氢二钠(天津市大茂化学试剂厂);乙醇、甲醇(天津市百世化工有限公司);三氯甲烷(衡阳市凯信化工试剂有限公司);氢氧化钠(广州市海珠区化学试剂厂);无水硫酸钠(天津市致远化学试剂有限公司),所用试剂均为分析纯。DA-201、NKA-II、DM-301、DM-130、NKA-9、AB-8、D-101 大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)。

1.3 药品 盐酸小檗碱对照品(批号:0713-200208,中国药品生物制品鉴定所);飞龙掌血药材购自广州致信中药饮片有限公司,经广州中医药大学周劲松副教授鉴定为芸香科植物飞龙掌血Toddalia asiatica Lam 的干燥根。

2 方法与结果

2.1 分析方法[10]

2.1.1 对照品溶液的制备 取小檗碱对照品适量,精密称足,置称足量瓶中,加甲醇溶解并稀释成每1ml 含小檗碱50μg 的对照的溶液。精密吸取浓度为50μg·ml-1小檗碱对照品溶液3.0ml,空气吹干后精密加入酸性染料溶液4.0ml 及4.0ml 缓冲液,用10.0ml 氯仿萃取,加少量无水硫酸钠吸水。

2.1.2 阴性溶液的制备 精密吸取酸性染料溶液4.0ml 及缓冲溶液4.0ml,加10.0ml 氯仿萃,加少量无水硫酸钠吸水。

2.1.3 供试品溶液的制备 按单因素考察和正交试验得出的提取方法,取飞龙掌血药粉(40 目)约10g,25 倍量75%乙醇,75℃水浴回流提取40 min,提取液浓缩至无醇味,取上清液,稀释至适宜的质量浓度,备用。精密吸取原液。经静态和动态吸附后药液适量,20ml 量瓶中按对照品溶液的制备方法项下操作。

2.1.4 波长选择 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液进行全扫描,记录吸收曲线,对照品和供试品的吸收曲线形状一致,均在波长418nm 处有最大吸收,阴性溶液无干扰,故选择418nm 为测定波长。

2.1.5 标准曲线的绘制 精密吸取盐酸小檗碱对照品储备液(50μg·ml-1)0.6、1.2、1.8、2.4、3.0、3.6ml 于锥形瓶中,自“空气吹干”按“对照品溶液的制备方法”操作,418nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线,得回归方程为Y=0.044X+0.050,r=0.9991。线性范围2.87~22.91μg·ml-1

2.1.6 测定方法 精密吸取原液、经静态和动态吸附后药液适量,置20ml 量瓶中,按“标准曲线的绘制”项下操作,计算总生物碱的量。

2.2 树脂的筛选

2.2.1 树脂的预处理 分别取上述7 种大孔吸附树脂,在使用前一晚用蒸馏水浸泡洗至无醇味,备用。

2.2.2 碱静态吸附率比较 精密称取各树脂2.5g (湿重),置150ml 具塞三角瓶中,加入制备好的样品溶液 (0.4 g/mL)20ml,置于恒温摇床中振摇24h 后,测定样品液中总生物碱含量,计算树脂吸附率。上述7 种树脂吸附后,依次加入水10mL、75%乙醇25ml ×2 次,置于恒温摇床中依次振摇24h,测定各解吸液中总生物碱含量,计算解吸率。结果见表1。综合考虑吸附率和解吸率,选用AB-8型大孔树脂作为总生物碱纯化的载体。

2.3 AB-8 型大孔树脂纯化飞龙掌血总生物碱工艺参数

2.3.1 浓度对树脂吸附率的影响 取预处理树脂适量(相当于干树脂约1.0g),精密称定,分别加入0.2、0.4、0.6 g/ml 的样品液20.0ml,置于恒温摇床中振摇24h,测定树脂的静态吸附率,吸附率分别为75.62%,50.00%,54.52%。因此飞龙掌血总生物碱的最佳吸附浓度为0.2g/ml。

表1 不同型号大孔吸附树脂对总生物碱吸附与解析结果

2.3.2 pH 值对树脂吸附率的影响 将浓度0.2g/ml 样品溶液调成pH 值为4.0、5.0 (原液)、6.0、7.0 和8.0 的溶液,分别精密吸取20.0ml,置装有预处理树脂(相当于干树脂约1.0g)的具塞三角瓶中,恒温摇床中振摇24h,测定 树 脂 的 静 态 吸 附 率,分 别 是 79.24%、82.94%、83.29%、80.82%、79.14%,上样液最佳pH 值为5.0~6.0,用原药液上样即可。

2.3.3 树脂静态吸附平衡曲线的测定 取预处理树脂适量(相当于干树脂约1.0g),精密称定,加入浓度0.2g/ml 样品液20ml,置于恒温摇床中振摇,分别于0.5、1、2、3、4、6、8、12、24h 取样,测定AB-8 大孔树脂对总生物碱的吸附率,以吸附率对时间作图,绘制AB-8 树脂对总生物碱的静态吸附平衡曲线。由图1 可知,吸附4h 后树脂对总生物碱吸附率基本不再变化,说明AB-8 型树脂对总生物碱的吸附速度较快,4h 即达到吸附平衡。

2.3.4 流速对树脂吸附量的影响 将等量的0.2g/ml 样品液分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h 的流速通过树脂层析柱,考察不同流速对树脂吸附量的影响。结果吸附量依次 为88.34、87.66、87.82、84.95、74.77mg/g,表 明AB-8 型树脂对总生物碱的最佳吸附流速为3BV/h。

2.3.5 总生物碱在AB-8 树脂上的泄露曲线 将0.2g/ml的样品溶液加到AB-8 树脂层析柱中进行动态吸附,流速3BV/h,按保留体积分段收集流出液,并测定各段流出液中总生物碱的浓度,以流出液中总生物碱浓度对上样体积作图,绘制泄露曲线。由图2 可知,第9个保留体积液中总生物碱明显增多,说明上样至第8个保留体积时总生物碱开始明显泄漏。综合考虑,选择上样量为8BV。

2.3.6 洗脱方法的考察 向充分吸附飞龙掌血提取液后的AB-8 大孔树脂中加入2BV 水,置于恒温摇床中振摇24 h后,测定水解析液中总生物碱含量。再向水解吸后树脂中依次加入各5BV 不同浓度的乙醇 (10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%),同法操作,测定醇解析液中总生物碱的含量,结果见表2。考虑成本,确定洗脱方法为水洗脱后,依次用5BV 10%、20%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脱。

表2 不同洗脱液对总生物碱解析率结果

2.4 工艺验证 根据上述确定的树脂类型和工艺条件,用3 根树脂柱同时进行纯化试验,初步确定飞龙掌血生物碱纯化工艺为:采用AB-8 大孔树脂,湿法装柱,上样药材浓度为0.2g/ml,pH 值5.0~6.0,药材与干树脂质量之比为2.3∶1,室温下以3.0 BV/h 的体积流速进行吸附饱和。解吸时,先以2BV 的水洗脱(弃去),再依次用5BV 10%、20%、30%、40%、50%、60% 乙 醇 洗 脱。吸 附 率80.27%,解吸率为72.87%,生物碱纯度从9.15%提高至为39.09%,工艺稳定可行。

3 讨论

本文围绕大孔树脂纯化的“上样-吸附-洗脱”步骤进行考察,设定的工艺参数便于实际操作与应用。醇解吸前先用水洗脱杂质、色素等,但水对飞龙掌血生物碱有一定的解吸作用,为了生物碱收率需要控制洗脱用水量。其结果表明试验方案证可行,对工业生产有一定指导意义。

在酸性染料法测总生物碱含量的操作时应注意避光,且不同pH 对结果影响较大。在预实验中对缓冲溶液的pH值进行了考察,配制pH 分别为4、4.5、5、5.5 的缓冲溶液,在其他条件相同时对同提取液进行萃取分离,检测其含量,结果显示当pH 为5.5 时总生物碱的含量最高,所以严格控制水相pH 为5.5。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草(苗药卷) [M].贵阳:贵阳科技出版社,2005:108.

[2]张艳焱,徐剑,张永萍.贵州不同产地苗药飞龙掌血中总生物碱和白屈菜红碱的含量测定[J].安徽农业科学,2012,40 (27):13322-13323.

[3]栗世铀,乔延江,肖培根,等.飞龙掌血抗A 型流感病毒活性的鉴定[J].中国中药杂志2005,30 (13):998-1001.

[4]许颖,郭婧玉,刘学,等.飞龙掌血乙醇提取物对白色念珠菌抑菌作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18 (10):270-274.

[5]丁文,文赤夫,陈建华,等.飞龙掌血提取物抑菌作用初步研究[J].生物质化学工程,2007,41 (5):33-35.

[6]任先达,何小萍.飞龙掌血水提物对异丙肾上腺素致大鼠心肌缺血的保护作用[J].暨南大学学报:医学版,1998,19 (2):22-26.

[7]石磊,李东,康文艺.飞龙掌血化学成分和药理作用研究进展[J].中国药房,2011,22 (7):666-668.

[8]郝小燕,彭琳,叶兰,等.龙掌血生物总碱抗炎镇痛作用的研究[J].中西医结合学报,2004,2 (6):450-452.

[9]石磊,李昌勤,廉婷婷,等.见血飞对小鼠出血时间和凝血时间的影响[J].中国药房,2010,21 (47):4424-4425.

[10]范圣洁,李文龙,崔文霞,等.酸性染料比色法测定飞龙掌血提取物中总生物碱的含量[J].上海中医药大学学报,2012,26 (1):85-89.

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