DNA分子标记技术及其在小麦遗传多样性研究中的应用

郑爱泉， 张宝林

(1.杨凌职业技术学院生物工程学院，陕西杨凌712100;2.贵州省农产品质量安全监督检验测试中心，贵州贵阳 550000)



DNA分子标记技术及其在小麦遗传多样性研究中的应用

郑爱泉1， 张宝林2

(1.杨凌职业技术学院生物工程学院，陕西杨凌712100;2.贵州省农产品质量安全监督检验测试中心，贵州贵阳 550000)

研究小麦遗传多样性对其遗传育种、种质资源保护、开发及利用均具有重要的意义。概述了几种主要小麦遗传多样性研究的DNA分子标记，如RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SRAP等技术的基本原理、特点及其优缺点等，进而探讨了这些分子标记技术在小麦遗传多样性研究中的作用和意义，为拓宽小麦遗传基础、提高小麦遗传变异育种提供理论基础。

分子标记技术；小麦；遗传多样性

遗传多样性是物种内不同群体或群体内不同个体间遗传变异的总和，是生物多样性的基础和核心，决定着生物多样性的形成和发展。造成遗传多样性的根源是其遗传物质的改变，即遗传变异越大，其遗传多样性越丰富。遗传多样性是进行小麦遗传育种改良的基础。遗传多样性的研究，无论是对于小麦种质资源的搜集与保持，还是对于资源评价和利用、物种的演化过程研究及遗传资源核心种质的建立均具有重要意义[1-2]。遗传多样性的评价是小麦育种研究的重要内容，它决定着小麦种质在今后遗传育种工作实践中的有效利用。

小麦属于禾本科小麦属(TriticumL.)，是世界上种植面积最大、总产量最多的粮食作物之一[1]。小麦属中有20多个种，常见的多为普通小麦(T.aestiuumL.)，占小麦种植总面积的90%以上；硬粒小麦(T.durumL.)，占种植总面积的8%左右；圆锥小麦(T.trugidumL.)、密穗小麦(T.compaecumL.)和斯卑尔脱小麦(T.speltaL.)等[3]。由于小麦种植生态区的环境气候差异及其长期的自然选择作用等，使得不同小麦种间存在明显的不同，特别是在小麦的野生近缘植物中表现出丰富的特异性遗传性状。然而，该特点不仅是改良小麦栽培、培育优良品种的重要原始材料，也是进行小麦遗传多样性研究的重要素材。目前，随着不同研究学科间的交叉和融合，研究小麦种群遗传学的方法也在不断发展和完善。先后经历了形态标记、细胞标记、生化标记和DNA分子标记等阶段[4]。但DNA分子标记方法不仅能够适应于不同发育时期的个体、任何的组织器官甚至可以利用细胞做检查；此外，DNA分子标记不受环境条件的影响和其基因表达与否的限制。因此，DNA分子标记被普遍认为是研究生物遗传差异的理想手段[5-6]。

1 DNA分子标记及其特点

分子标记是指可遗传的并可有效检测种群内或种群间遗传分化及遗传多样性程度的DNA序列或蛋白；狭义上，分子标记是指能反映生物个体或种群基因组中某种差异的特异性DNA片段。最早的分子标记是以淀粉凝胶电泳技术为基础的等位酶电泳。随着现代分子生物学的不断发展，分子标记技术先后经历了3个大的发展阶段，分别为以Southern杂交为基础的RFLP标记；以链式聚合酶式反应为基础的RAPD、SSR、AFLP标记和DNA 测序等及以基因组序列为基础的SNP标记等[7-8]。每一种分子标记都有其自身的优点及其适用范围。理想的分子标记应该具备以下几个优点：①遗传多态性高，信息量大及遗传差异分辨率高；②共显性遗传，信息完整，可以有效地区分杂合体和纯合体，对隐性性状的选择十分方便；③在基因组中大量存在且分布均匀；④开发使用成本低，试验操作简便，易于实现自动化；⑤样品组织或DNA模板用量少，且样品质量要求相对不高；⑥选择中性，无表型效应，不受环境限制和影响。目前，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术种类至今多达几十种。

2 分子标记技术概述

2.1 限制性片断长度多态性标记技术(RFLP) RFLP是20世纪80年代研究生物遗传多态性的方法[9]。RFLP具有共显性、更高的多态性、高度的稳定性、重显性和适应范围广等优点。但在进行RFLP分析时需要使用放射性同位素及其核酸杂交技术，其操作过程比较繁琐，不安全且不宜自动化操作。Siedler 等[10]利用RFLP分子标记技术分析了不同小麦品种间的遗传多样性及其遗传变异情况。2001年，贾继增等[11]利用473个RFLP探针分析来自不同国家小麦品种间的遗传多样性差异，结果发现普通小麦品种间的遗传多样性明显低于其他作物的遗传多样性，说明普通小麦的遗传基础更为狭窄，且B基因组的遗传多样性较高，而D基因组的遗传多样性较差。

2.2 随机扩增片段长度多态性标记技术(RAPD) RAPD是1990年由Williams所领导的研究小组和Welsh、MeClelland等2位科学家同时提出的一项基于PCR的分子标记技术。RAPD技术的优点是可以对物种在没有任何分子生物学研究的情况下，对物种基因组进行DNA片段的多态性分析；可以运用上百种引物对整个基因组进行多态性分析；RAPD的随机引物数量大，可无限合成，且一套引物可以用于任何物种基因组中，省时省力，经济易行。1993年，Joshi等[12]利用RAPD标记技术研究了15个小麦品种的遗传多样性，且依据获得的多态性结果并结合其他方法成功构建了小麦品种遗传关系树状图。该技术虽然共显性遗传，但无法区分杂合子和纯合子；结果重复性差等。

2.3 扩增片段长度多态技术(AFLP) AFLP是1993年由Zabeau Marc和Vos Pieter发明的一种检测基因组DNA多态性技术。它既具有RFLP技术的可靠性又具有PCR技术的高效性和简易性[13]。AFLP也有其缺点[14]：产生的标记多数是显性的，操作技术较复杂，试验条件要求高等。由于AFLP技术结合了RFLP技术和PCR技术的优点，相比于单纯的RAPD技术具有更大的优越性。郝晨阳等[15]采用AFLP技术分析了我国西北春麦区小麦育成品种间的遗传多样性，研究结果为我国小麦种质资源鉴定和遗传多样性研究提供了丰富的理论基础。Bohn等[16]分别利用RFLP、AFLP和SSR 3种分子标记技术分析了德国和澳大利亚冬小麦的遗传多样性，结果表明这3种分子标记技术所反映出的遗传多态性信息含量PIC值不存在显著性差异，但比较发现AFLP对遗传多态性的检测效果更高。

2.4 微卫星DNA标记(SSR) SSR是指一段简单重复的DNA片段，其每个重复单位一般为1～4个碱基，重复数为10～20次，如(GA)n、(AC)n、(GAA)nA等，该片段广泛存在于基因组的间隔顺序及内含子等非编码区内[17]。微卫星标记具有数量多、分布广、多态性丰富、共显性遗传、易检测、适用于自动化分析等特点[18-20]。崔国惠等[21]对15份我国不同生态区的普通小麦品种和9份不同国家的斯卑尔脱小麦品种进行微卫星分子标记，其中96.78%的扩增条带具有多态性，且斯卑尔脱小麦品种间的位点多态性高于普通小麦品种间的位点多态性；分析斯卑尔脱小麦品种与普通小麦品种间的遗传距离发现，斯卑尔脱小麦与普通小麦间的平均遗传距离为0.651 7 CM，且两者存在较大的遗传差异。Plaschke等[22]利用SSR技术分析了40个亲缘关系较近的小麦品种间的遗传差异，结果发现所有品种中每对引物均具有较丰富的遗传多态性，且该研究结果显示相对较少的SSR位点即可完成小麦种质资源间遗传多样性的检测。

2.5 序列相关扩增多态性(SRAP) SRAP 是2001年由美国加州大学蔬菜作物系Li等提出，该方法是一种新型的、基于PCR的分子标记技术。其原理是利用独特的引物设计对开放阅读框架(OEFs)进行PCR扩增，由于个体间的差异或者物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性的差异。SRAP标记技术具有操作简便、过程快速、引物设计简单以及多态性和信息量丰富的特点，被广泛应用于植物遗传多样性分析、基因标记、定位及其遗传连锁图的构建等方面[23-25]。

3 分子标记技术特征比较

分子标记作为新的遗传标记，虽然具有非常多的优点，但目前尚不存在一种分子标记技术可以满足理想分子标记的所有要求。不同分子标记技术由于PCR标记体系类型多样，其各自的复杂性、可靠性及遗传信息不同。如RAPD标记方法简单、成本低，但重复性较差、检测位点不多；SSR标记多为共显性，重复性好，但位点较少，引物开发成本较高；AFLP谱带多，但试验操作过程复杂，需要同位素标记，常因基因组DNA的甲基化造成“假多态性”现象，适用成本高[26-27]。因此，应用时应根据研究的需要及其试验条件，选取相应适用的标记技术。

4 分子标记技术在小麦遗传多样性中的应用

4.1 分子标记的多态性与小麦品种亲缘关系分析 明确小麦品种间亲缘关系是拓宽小麦栽培面积、进行合理基因布局及研究小麦遗传背景的基础。目前，研究小麦品种间亲缘关系的方法一般有2种，一种是追溯小麦品种的系谱，通过系谱间的亲缘关系远近了解不同小麦品种间的亲缘关系；另一种是通过分子标记技术研究小麦间的遗传差异，通过计算品种间遗传距离的大小来确定品种间遗传差异的多少，进而评价不同小麦品种间的亲缘关系。系谱分析方法简单直观，但很难确保各品种间系谱的准确性和可靠性，错误的系谱或是不完全清楚的系谱不能真实地反映品种间的亲缘关系，且每个品种遗传双亲的血缘并不一定全为1/2，因此通过追溯系谱分析品种间的亲缘关系存在较大误差。通过分子标记技术计算不同品种间的遗传距离，不仅准确、可靠，而且简单、快捷，但该方法的缺点是试验耗费较大。

孙其信等[28]利用RAPD标记技术对我国40个小麦品种进行遗传多态性分析，确定了小麦品种间基因型的遗传差异及不同品种间的亲缘关系，该结果对小麦杂种优势群的划分起着重要的作用。景蕊莲等[29]利用分子标记技术分析了我国国家种质库中3个平遥小麦种质的亲缘关系，结果显示，ZM1213平遥小麦与燕大1817的相似程度最高；对平遥小麦、蚂蚱麦及其衍生品种的谱系亲缘关系进行聚类分析，研究结果与系谱中的亲缘关系结果基本一致。李宏伟等[30]利用新型分子标记EST-SSRs技术对小麦遗传多样性进行研究，结果显示，部分引物可以用于普通小麦及其近缘种属的亲缘关系，且可以依据特征带谱进行小麦品种的鉴定。宋迎辉等[31]利用系谱分析方法和SSR标记方法对河南省小麦主要推广品种间的亲缘关系进行了研究，结果表明在河南省主要推广的10个小麦品种间其血缘关系较近，其中，豫麦2号和丰产3号为骨干亲本；分子标记结果显示11个小麦品种中均具有丰富的遗传多态性，通过计算不同小麦品种间遗传距离的大小可以判断各品种间的亲缘关系远近。利用分子标记手段探讨不同小麦品种间的遗传差异及其品种间的亲缘关系是小麦种质资源工作的重要内容[3]。

4.2 小麦种质资源多样性及其品质鉴定研究 有效地评价小麦种质资源的遗传多样性和正确地鉴定小麦种质资源的品质是拓宽小麦遗传基础、培育优良品种的科学依据。而分子标记是检测小麦种质资源多样性的有效工具[3,5-6]。在早期，Siedler等[10]利用RFLP分子标记技术研究斯卑尔脱小麦与普通小麦之间的遗传差异，结果发现小麦间的平均遗传差异为春性普通小麦<斯卑尔脱小麦>冬性普通小麦[10]。Sun等[32]运用RAPD标记对西藏半野生小麦、普通小麦和斯卑尔脱小麦3种小麦品种进行了遗传多样性研究，结果发现西藏半野生小麦和斯卑尔脱小麦的群体间遗传变异较大，且西藏半野生小麦和斯卑尔脱小麦与普通小麦间也存在显著的群体遗传差异，该研究结果不仅可以丰富普通小麦育种亲本的遗传基础，还可以扩大亲本间的遗传差异。贾继增等[11]利用分布于21条染色体上的473个RFLP探针分析了不同国家小麦品种间的遗传多样性，结果发现普通小麦品种间的遗传多态性水平明显低于其他作物品种间的遗传多样性水平，该研究说明普通小麦的遗传基础相对而言更为狭窄，其中在B基因组中的小麦遗传多样性较高，而在D基因组间的小麦遗传多样性最差。因此，小麦种质资源多样性及其品质鉴定的研究结果对在小麦育种中如何引进新的遗传变异种质及杂优育种具有重要的指导意义。

4.3 小麦品种间遗传多样性研究 研究小麦遗传多样性不仅可以为了解小麦物种的起源、品种的分类、亲本额选配及核心种质资源的构建等提供科学依据，还是研究、保护和利用现有种质资源的重要前提条件。Barrett等[33]利用AFLP 技术研究了太平洋西北地区小麦品种间遗传多样性差异，结果发现不同小麦品种间的遗传多样性为冬性小麦遗传多样性>春性小麦遗传多样性；此外，还发现冬性小麦与春性小麦进行杂交或同一生态习性的不同类型进行杂交其遗传多样性更为丰富，且群体间较大的遗传变异有助于丰富育种群体的遗传基础。李宏伟等[30]利用SSR分子标记技术研究了96份小麦材料的遗传多样性，对于小麦重要基因的开发、保存与利用具有重要意义。陈新民等[34]利用 59 对 SSR 引物研究了 48 份优质小麦品种的遗传多样性，认为品种间的遗传差异与系谱结果较吻合。 耿惠敏等[35]利用 43 对 SSR引物对河南省审定的 40 个小麦品种的遗传多样性进行了研究， 认为品种间的遗传差异较小。高睦枪等[36]利用 53 对SSR 引物研究了48个在1999～2000 年由北方冬麦区及黄淮冬麦区观察圃中选出的新品种或新品系间的遗传差异，结果表明我国冬小麦品种的种质基础相对较狭窄。詹克慧等[37]利用79个微卫星位点对黄淮麦区129份小麦种质资源进行遗传差异分析，揭示了不同小麦材料的遗传差异及其遗传关系。Fahima等[38]利用分子标记技术研究了野生二粒小麦、硬粒小麦及普通小麦间遗传差异，且通过UPGMA聚类群分析方法揭示了野生二粒小麦的遗传多样性与地理分布的关系。对于小麦品种间遗传差异及其多样性的研究，Plaschke等[22]和 Bohn等[16]利用小麦 SSR 标记对普通小麦品种间的遗传差异进行了研究，认为微卫星标记的多态性和检测效率明显高于 RELP 和 RAPD 标记。

王凤涛等[39]利用SRAP标记技术研究了22个河南小麦栽培品种的遗传多样性，结果显示平均多态性条带数为7，即SRAP标记表现出较高的多态性，该研究结果高于王林海等[40]利用SSR标记技术对黄淮麦区130个推广品种的遗传多样性分析的多态性条带数(4.3条带/引物对)。SRAP标记揭示的DNA多态性高于SSR标记。基于标记的原理不同，SRAP标记技术与SSR、AFLP等技术相比更具有目的性和较高的多态性，更能揭示不同品种间的遗传差异。

研究表明小麦种属间的遗传多样性丰富，而普通小麦品种间的遗传多样性低，其原因可能是由于大量使用相同的骨干亲本和单一的育种方法造成的[2-3,31]。因此，加强对现有栽培小麦及其野生近缘种质的研究和利用，创造和引进新种质、丰富小麦的遗传基础等将有利于拓宽普通小麦的遗传多样性，进而有利于小麦的遗传育种、品质鉴定及其资源保护等。

[1] 董玉琛,郑殿升.我国小麦遗传资源[M].北京:中国农业出版社，2000.

[2] 张海泉,张宝石.山羊草及普通小麦遗传多样性的研究[J].沈阳农业大学学报,2005,35(3):165-169.

[3] 高秀琴,兰进好,穆平,等.小麦遗传多样性研究进展[J].山东农业科学,2007(3):33-36.

[4] 刘光兴.遗传标记技术在海洋桡足类生物多样性和系统发生研究中的应用[J].中国海洋大学学报,2007,37(1):33-37.

[5] 王长有,吉万全,薛秀庄.分子标记技术在小麦遗传育种中的应用现状[J].麦类作物学报,2000,20(4):75-80.

[6] 白玉.DNA 分子标记技术及其应用[J].安徽农业科学,2007,35(24):7422-7424.

[7] 王志林,赵树进,吴新荣.分子标记技术及其发展[J].生命的化学,2001(4):39-42.

[8] ALMANZA-PINZON M I,KHAIRALLAH M,FOX P N,et al.Comparison of molecular markers and coefficients of parentage for the analysis of genetic diversity among spring bread wheat accessions[J].Euphytica,2003,130(1):77-86.

[9] LANSMAN R A，SHADE R O，SHAPIRA J F,et al.The use of restriction endonucleases to measure mitochondrial sequence relatedness in natural populations.III.Techniques and potential Applications[J].Journal of Molecular Evolution,1981,17:214-226.

[10] SIEDLER H,MESSMER M M,SCHACHERMAYR G M,et al.Genetic diversity in European wheat and spelt breeding material based on RFLP data[J].Theoretical and Applied Genetics,1994,88(8)：994-1003.

[11] 贾继增,张正斌,DEVAS K,等.小麦21条染色体AFLP作图位点遗传多样性分析[J].中国科学,2001,31(1):13-21.

[12] JOSHI C P,NGUYEN H T.RAPD (random amplified polymorphic DNA) analysis based intervarietal genetic relationships among hexaploid wheats[J].Plant Science,1993,93(1):95-103.

[13] LOXDALE H D，LUSHAI G.Molecular markers in entomology[J].Bulletin of Entomlological Researeh,1998,88:577-600.

[14] YAN Z,DENNEBOOM C,HATTENDORF A,et al.Construction of an integrated map of rose with AFLP,SSR,PK,RGA,RFLP,SCAR and morphological markers[J].Theoretical and Applied Genetics,2005,110(4):766-777.

[15] 郝晨阳,王兰芬,董玉琛,等.我国西北春麦区小麦育成品种遗传多样性的 AFLP分析[J].植物遗传资源学报,2003,4(4):285-291.

[16] BOHN M,UTZ H F,MELCHINGER A E.Genetic similarities among winter wheat cultivars determined on the basis of RFLPs,AFLPs,and SSRs and their use for predicting progeny variance [J].Corp Science,1999,39:22-23.

[17] HAMADA H,PETRINO M G,KAKUNAGA T.A novel repeated element with Z-DNA-forming potential is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1982,79(21):6465-6469.

[18] WEBER J L,MAY P E.Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction [J].American Journal of Human Genetics,1989,44:388-396.

[19] 孙 伟.微卫星DNA的研究与应用[J].黑龙江畜牧兽医，2001(3):10-12.

[20] 张 玲.微卫星DNA标记研究进展及应用[J].安徽农业科学,2007,35(4):972-975.

[21] 崔国惠,倪中福,刘志勇,等.小麦杂种优势群研究Ⅲ：普通小麦和斯卑尔脱小麦微卫星分子标记遗传差异的研究[J].农业生物技术学报,1999,7(4):333-338.

[22] PLASCHKE J,GANAL M W,RÖDER M S.Detection of genetic diversity in closely related bread wheat using microsatellite markers [J].Theoretical and Appliled,1995,91(6/7):1001-1117.

[23] 杨平,刘仙俊,刘新春,等.利用SRAP标记研究四川高原青稞育成品种的遗传多样性[J].遗传,2008，30(1):115-122.

[24] 文雁成,王汉中,沈金雄,等.用SRAP标记分析中国甘蓝型油菜品种的遗传多样性和遗传基础[J].中国农业科学,2006,39(2):246-256.

[25] 林忠旭,张献龙,聂以春,等.棉花SRAP遗传连锁图构建[J].科学通报, 2003,48(15):1676-1679.

[26] 方宣钧,吴为人,唐纪良.作物DNA标记辅助育种[M].北京:科学出版社,2001.

[27] LIU L,GUO W,ZHU X,et al.Inheritance and fine mapping of fertility-restoration for cytoplasmic male sterility inGossypiumhirsutumL.[J].Theor Appl Genet,2003,106:461-469.

[28] 孙其信,黄铁诚,倪中福.小麦杂种优势群研究:I.利RAPD标记研究小麦品种间遗传差异[J].农业生物技术学报,1996,4(2):103-109.

[29] 景蕊莲,昌小平.SSR标记在小麦种质资源研究中的应用[J].作物品种资源,1999,17(2):17-20.

[30] 李宏伟,高丽锋,刘曙东,等.用EST-SSRs研究小麦遗传多样性[J].中国农业科学,2005,38(1):7-12.

[31] 宋迎辉,吴少方,王林海,等.河南省小麦主要推广品种间的亲缘关系研究[J].中国农学通报,2007,23(3):181-184.

[32] SUN Q X,NI Z F,LIU Z Y,et al.Genetic relationships and diversity among Tibetan wheat,common wheat and Europcan spelt wheat revealed by RAPD markers [J].Euphytica,1998,99:205-211.

[33] BARRET B A,KIDELL K K,FOX P N.Comparison of AFLP and pedigree-based genetic diversity assessment methods using wheat cultivars from Pacific North West [J].Crop Science,1998,38:1271-1278.

[34] 陈新民,何中虎,史建荣,等.利用SSR标记进行优质冬小麦品种(系)的遗传多样性研究[J].作物学报,2003,29(1):13-19.

[35] 耿惠敏,刘红彦,宋玉立,等.40个河南省审定小麦品种遗传多样性的SSR标记分析[J].西北农业学报,2005,14(2):27-32.

[36] 高睦枪,郭小丽.我国部分冬小麦新品种(系)SSR标记遗传差异的研究[J].农业生物技术学报,2001,9(1):49-54.

[37] 詹克慧,王林海,程西永,等.黄淮麦区部分小麦种质资源的遗传差异分析[J].农业生物技术学报,2006,14(4):578-584.

[38] FAHIMA T,RÖDER M S,GRAMA A,et al.Microsatellite DNA polymorphism divergence in Triticum dicoccoides accessions highly resistant to yellow rust[J].Theoretical and Applied Genetics,1998,96(2):187-195.

[39] 王凤涛,蔺瑞明,欧阳宏雨,等.利用SRAP标记分析河南小麦栽培品种的遗传多样性[J].植物遗传资源学报,2009,10(4):517-521.

[40] 王林海,田志强,董中东,等.SSR标记技术在小麦品种遗传多样性上的应用[J].河南农业大学学报,2007,41(1):5-11.

Application of DNA Molecular Maker Techniques in Genetic Diversity of Wheat

ZHENG Ai-quan1， ZHANG Bao-lin2

(1.College of biotechnology,Yangling Vocational and Technical College, Yangling, Shaanxi 712100;2.Agricultural Products Quality Safety Supervision and Testing Center of Guizhou Province, Guiyang,Guizhou 550000)

The research of genetic diversity plays an important role of wheat genetic breeding and germplasm resources protection, development and application. The basic principles, characteristics, advantages and defects of a few types of molecular markers, such as RFLP, RAPD, AFLP, SSR and SRAP were reviewed. Further more, the role and significance of molecular markers in wheat genetic diversity were studied, which will offer theoretical basis in broadening wheat genetics and improving genetic breeding.

Molecular maker; Wheat; Genetic diversity

郑爱泉(1980- )，男，甘肃靖远人，讲师，博士，从事小麦遗传育种研究。

2015-04-23

S 188+.1

A

0517-6611(2015)17-040-03