5种长白山野生食用菌的抗肿瘤活性研究

李 雪 李鹏飞 李晓东 于 婷 金乾坤 崔承弼

（1.延边大学医学院，吉林 延吉 133002；2.延边大学农学院，吉林 延吉 133002）

中国东北部长白山地区的野生食用菌共有28科82属297种［1］，不但为该地区的人民提供了丰富的食材、药材资源，还成为了该地区的主要经济作物之一。常见的主要有猴头蘑、灵芝、元蘑、黑木耳、桦褐孔菌、榛蘑等17种食用菌。其中元蘑、榛蘑、猴头蘑被称作东北“三大蘑”［2］。长白山野生食用菌不但具有很好的食用品质和营养价值，而且还具有一些生理活性功能，如抗氧化、抗衰老和增强免疫力等功能［3－7］。许多研究［8－16］还表明食用菌不仅含有很 高的 营养价值而且还可以作为药物预防和治疗许多疾病。

随着时代的发展，人们生活水平提高，生活的压力变大以及严重的环境污染使癌症人群迅速增加［17］。在全世界范围内，恶性肿瘤被公认为是仅次于心脑血管疾病的第二大致命性疾病，对于癌症的预防与治疗已经引起了国际上的普遍关注［18］。常规的手术、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也严重损害宿主的免疫系统，而合成的抗癌药对人体正常细胞可能产生毒副作用。流行病学与预防医学研究［19］显示，植物中存在多种天然抗癌活性成分，它们因较低的毒副作用和广泛的来源，受到了世界范围内的高度重视。本试验在单一食用菌生理活性研究的基础上，聚焦长白山5种野生食用菌，通过体外和体内试验来测定其提取物的抗肿瘤活性，并对这5种常见野生食用菌的抗肿瘤活性进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长白山野生食用菌：灵芝、桦褐孔菌、桑黄、猴头蘑、香菇，均购置于吉林省安图县土特产市场；

DMEM培养基干粉、胎牛血清：美国GIBCO公司；

MTT粉剂、二甲基亚砜（DMSO）：美国Sigma公司；

其他试剂：均为分析纯化学试剂。

1.2 仪器设备

电子天平：JA10003N型，民桥精密科学仪器有限公司；

酶联免疫检测仪：DG5033A型，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司；

CO2培养箱：MCO175型，日本三洋公司；

荧光倒置显微镜：CKX-41型，日本OLYMPUS公司；

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-75S11型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验动物

SPF级Balb/c，体重18～22g，雌雄各半，由延边大学实验动物中心提供。动物在IVC动物实验室适应性饲养3d，室温20～24℃，相对湿度40%～65%，换气次数10～20次/h，压差20～50Pa。

1.4 试验用癌细胞株

子宫宫颈癌细胞（HeLa）、肺癌细胞（A549）、乳腺癌细胞（MCF-7）、肝癌细胞（HepG2）、小鼠S-180肉瘤细胞株、正常肾脏293细胞：特殊肿瘤细胞株公司。

1.5 试验方法

1.5.1 野生食用菌提取物的制备 称取5种野生食用菌各1kg，分别加70%乙醇10L，加盖常温下浸泡24h，加热（90℃）回流提取2次，每次2h，趁热过滤，合并2次滤液，浓缩沉淀，回收乙醇，热风50℃烘干备用。

1.5.2 体外肿瘤抑制试验方法 将子宫宫颈癌细胞（He-La）、肺 癌 细 胞 （A549）、乳 腺 癌 细 胞 （MCF-7）、肝 癌 细 胞（HepG2）在含有10%胎牛血清的DMEM培养基上培养至对数期后，将细胞的浓度调整为5×103个/mL，96孔板接种（100μL/孔），每个提取物6个复孔，并设对照孔（加DMEM培养基），在37℃、5%CO2的条件下培养24h。然后，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h。终止培养，吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，酶标仪振板10s，在波长为492nm下测定其吸光度。

1.5.3 体内肿瘤抑制试验方法 选择培养7～10d生长良好的S-180肉瘤瘤株，无菌取腹腔积液，用0.9%无菌生理盐水按1∶3稀释成瘤细胞悬液，并计数调整细胞浓度为1×107个/mL，用体重18～20g的Balb/c小鼠180只，每只0.2 mL接种至小鼠右侧腋窝下方。24h后选择状态良好的小鼠，称重后随机分为18组：空白对照组和灵芝、桑黄、猴头蘑、桦褐孔菌香菇低、中、高剂量给药组。每组10只，各组灌胃给药，低、中、高剂量分别为25，125，250mg/mL，连续给药20d，空白对照组给予同体积的0.9%氯化钠溶液，停药次日处死动物。解剖剥离瘤块，称瘤重，按式（1）计算肿瘤抑制率［20－23］。

2 结果分析

2.1 食用菌提取物体外肿瘤抑制试验结果

2.1.1 提取物对HeLa细胞的生长抑制作用 由图1可知：随浓度的增加，各提取物的抑制效果不断增强。在提取物浓度为1.0mg/mL时，灵芝、猴头蘑和香菇对HeLa有70%以上的生长抑制效果，其中以灵芝的效果最为显著，浓度在0.75mg/mL时能达到81.0%的抑制效果。在李梦媛等［24］的研究中所采用的灵芝多糖浓度在5mg/mL时，对Hela细胞的抑制率为22.9%。T.C.Finimundy等［25］测定了巴西香菇提取物对Hela细胞的抑制作用，结果显示，22℃条件下提取的香菇提取物有最高的抑制效果，其IC50值为0.57%。与以上两项研究的结果相比，本研究所采用的长白山地区的食用菌在抑制Hela细胞的生长方面更具优势，且抑制效果依次为：灵芝＞香菇＞猴头蘑＞桦褐孔菌＞桑黄。

图1 野生食用菌提取物对人体子宫宫颈癌细胞（HeLa）的抑制Figure 1 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to HeLa cells

2.1.2 提取物对HepG2细胞的生长抑制作用 由图2可知：随着5种食用菌提取物浓度的增加，其对HepG2细胞的抑制效果逐渐增强，并且在该试验中，以灵芝和猴头蘑对HepG2细胞的抑制作用最为明显，桑黄与桦褐孔菌次之，而香菇的作用最小。在浓度为1.0mg/mL时，灵芝和猴头蘑对肝癌细胞HepG2的抑制率分别为71%和76.3%。Jong Seok Lee等［26］也做了与本试验相似的研究，他们研究了韩国猴头蘑对HepG2细胞的抑制作用，结果显示猴头蘑提取物浓度在1 000μg/mL时对HepG2细胞的抑制作用还不到40%，与本研究的结果有较大差异，推测其可能是由于采用了不同的提取方法得到了不同的活性组分导致的。在章慧等［27］的研究中，分别使用乙醇浸提与超临界CO2萃取的方法制作了灵芝提取物，这两种提取物浓度在100μg/mL时，对HepG2的生长抑制率分别为66.15%和78.85%，效果明显高于本研究结果。究其原因，应该是该试验选用的灵芝对HepG2细胞的抑制作用优于本研究所采用的灵芝，另一方面可能超临界CO2的方法使灵芝浓缩物具有更高的抗肿瘤活性。

图2 野生食用菌提取物对人体肝癌细胞（HepG2）的抑制Figure 2 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to HepG2cells

2.1.3 提取物对 MCF-7细胞的生长抑制作用 由图3可知，5种食用菌提取物对人乳腺癌细胞均有一定的抑制作用，并且同样存在一定的浓度依赖关系。与对宫颈癌细胞和肝癌细胞抑制效果不同的是，对乳腺癌细胞的抑制效果最好的食用菌并不一致。同样浓度为1mg/mL时，桑黄的抑制率最高为81.5%，猴头蘑和桦褐孔菌的抑制率分别为76.6%和75.1%，并且桑黄、猴头蘑、桦褐孔菌和香菇提取物对MCF-7的抑制作用显著高于灵芝提取物，其顺序依次为：桑黄＞猴头蘑＞桦褐孔菌＞香菇＞灵芝。李宜明等［28］测定的桑黄提取物对MCF-7的抑制作用结果是在400μg/mL时，抑制率达到最高的55.39%，浓度上升到800μg/mL时，抑制率下降到了51.55%。与本研究的结果有一定的差别，推测当浓度达到800μg/mL时，其提取物的溶解已达到饱和，和本研究的情况有所不同。

图3 野生食用菌提取物对人体乳腺癌细胞（MCF-7）的抑制Figure 3 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to MCF-7cells

2.1.4 提取物对A549细胞的生长抑制作用 由图4可知：5种提取物均随着浓度的增加抑制作用不断增强。在浓度为1mg/mL时，猴头蘑和香菇表现出较强的抑制作用，抑制率分别为89%和81%，其他提取物的抑制率也均在50%以上，顺序为猴头菇＞香菇＞灵芝＞桑黄＞桦褐孔菌。其中灵芝提取物浓度对抑制率的影响较小，而猴头蘑和香菇提取物浓度对抑制率的影响较大，并且在浓度为0.75mg/mL时，猴头蘑和香菇提取物对A549细胞的抑制率已经超过灵芝。刘奔等［29］的研究也采用了香菇作为试验材料，研究了其对A549细胞的抑制作用，但其研究主要是提取了香菇中的凋亡相关蛋白，并测定了其对A549细胞的抑制作用，结果显示，该蛋白的浓度在30μg/mL时，A549细胞的凋亡率为30.95%。也证实了香菇对A549细胞具有促凋亡作用，与本研究的结果具有相似性，但由于其与本研究所采用的香菇提取物不同，所以结果也存在一定的差异。

图4 野生食用菌提取物对人体肺癌细胞（A549）的抑制Figure 4 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to A549cells

图5 野生食用菌提取物对正常肾脏细胞（293）的抑制Figure 5 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to 293cells

2.1.5 提取物对293细胞的生长抑制作用 由图5可知，5种食用菌提取物在不同浓度下对正常肾脏细胞的抑制作用均在50%以下，说明本研究所用的5种食用菌提取物对正常细胞的毒性作用较小。

2.2 体内抗癌效果

对5种野生食用菌提取物的体内抗癌效果利用Sarcoma-180肿瘤细胞进行验证，结果见表1。由表1可知，低剂量的桑黄提取物对S-180肉瘤的抑制率最低，为4.49%；而高剂量的猴头蘑的抑制率最高，达到75.92%。但是由于香菇的低浓度组就已经显示出了较高的抑制率（为69.39%），并且香菇高浓度组抑制率（为72.24%）与猴头蘑高浓度组抑制率（为75.92%）差别不大，因此可以认为香菇提取物对S-180肉瘤的抑制效果最好。

表1 野生食用菌提取物对体内S-180肿瘤的生长抑制效果Table 1 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to S-180sarcoma in vivo（n＝10）

表1 野生食用菌提取物对体内S-180肿瘤的生长抑制效果Table 1 The inhibition effect of wild edible mushrooms extract to S-180sarcoma in vivo（n＝10）

＊与空白对照组相比，P＜0.05。

分组 剂量 浓度/（mg·kg－1·BW）瘤重/g抑制率/%低剂量 25 1.89±0.25＊2.45±0.27 － 22.85灵芝 中剂量 125 1.28±0.16＊ 47.76高剂量 250 1.15±0.19＊ 53.06低剂量 25 2.34±0.65 4.49桑黄 中剂量 125 1.48±0.64＊ 39.59高剂量 250 1.11±0.75＊ 54.69低剂量 25 1.71±0.72＊ 30.21猴头蘑 中剂量 125 1.40±0.84＊ 42.86高剂量 250 0.59±0.42＊ 75.92低剂量 25 1.75±0.68＊ 28.57桦褐孔菌 中剂量 125 1.38±0.72＊ 43.67高剂量 250 0.92±0.18＊ 62.45低剂量 25 0.75±0.11＊ 69.39香菇 中剂量 125 0.72±0.18＊ 70.61高剂量 250 0.68±0.14＊ 72.24空白 －

3 结论与讨论

本试验以子宫宫颈癌细胞（HeLa）、肝癌细胞（HepG2）、乳腺癌细胞（MCF-7）、肺癌细胞（A549）、以及正常肾脏细胞293为研究对象，对5种野生食用菌提取物的体外抗肿瘤作用效果进行研究。结果发现，不同的食用菌提取物具有不同的抗肿瘤效果，并且不同肿瘤细胞均有其对应的抑制效果最好的食用菌提取物。整体看来，灵芝对HeLa及HepG2两种细胞株的抑制效果最好，对MCF-7细胞株桑黄的抑制率最高，而猴头菇对A549细胞显示了最强的抑制效果。这说明不同食用菌的不同功能成分具有不同的靶向作用。并且，除灵芝外，其余4种食用菌提取物均呈现了良好的剂量－效应关系。

进一步研究食用菌经过机体的消化吸收后的抗肿瘤作用，体内抗癌结果表明：猴头蘑高剂量组的抑瘤率最高，达到75.92%，但香菇低剂量组抑制率就达到了69.39%，高剂量时为72.24%。其他3种同样有抑制效果，并均呈现良好的剂量－效应关系。说明5种野生食用菌提取物对S-180小鼠肿瘤细胞均有一定的抑制作用。

体内和体外试验发现，长白山野生食用菌对体外培养的人源癌细胞具有较为明显的抑制作用，而对人的正常肾脏细胞无明显毒副作用，此外其对小鼠体内移植瘤同样有明显的抑制生长作用。与国内外相关研究的对比可以看出，本试验的结果与国内外的研究具有相似性，均能证明野生食用菌具有一定的抗肿瘤作用，但本试验所采用的长白山地区的野生食用菌对某些肿瘤细胞株具有更好的抑制生长效果。另外本试验对体内生长的人源肿瘤还未进行试验检测，也未对其机制做更为深入的探讨，在后续研究中，将会对人源肿瘤的抑制作用、临床试验以及其机理进行更为深入的探讨。

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