Chelex-100法和QIAcube纯化法在接触性检材检验中的比较

廖长青，成静，刘维

（湘潭市公安局刑科所，湖南湘潭 411100）

Chelex-100法和QIAcube纯化法在接触性检材检验中的比较

廖长青，成静，刘维

（湘潭市公安局刑科所，湖南湘潭 411100）

法医遗传学；Chelex-100法；QIAcube纯化法

在法医DNA检验中，能否提取到足够浓度与纯度的DNA模板，是决定DNA检验成败的关键之一。本研究分别采用Chelex-100法与QIAamp DNA Investigator试剂盒结合QIAcube核酸自动化提取仪（QIAcube纯化法）提取实际检案中的DNA，同等条件下进行PCR扩增与电泳，比较分析二者的图谱，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

65份接触性生物检材来自本实验室日常检案积累，其中瓶口32份，工具手柄18份，绳索衣物类15份。瓶口和工具手柄检材均采用生物物证提取专用棉签（公安部物证鉴定中心）干湿两步法提取；绳索衣物类检材采用脱落细胞粘取器（公安部物证鉴定中心）粘附提取。

1.2 DNA提取

1.2.1 Chelex-100法

取检材适量，剪碎后放入0.5mL离心管中，加入适量Chelex-100悬浊液与蛋白酶K溶液，恒温摇匀孵育仪（珠海博迈杰公司）上56℃孵育1.5h，煮沸10min，离心取上清液适量扩增。

1.2.2 QIAcube纯化法

取检材适量，剪碎后放入0.5mL离心管中，加入QIAamp DNA Investigator试剂盒（德国QIAGEN公司）中ATL裂解液300μL及蛋白酶K 20μL，恒温摇匀孵育仪上56℃孵育1.5 h，再使用试剂盒提供的MinElute离心柱在QIAcube核酸自动化提取仪（德国QIAGEN公司）上纯化提取DNA，洗脱体积30μL，取洗脱液适量扩增。

1.3 PCR扩增与STR分型

使用AmpFLSTR®Identifiler®Plus试剂盒（美国AB公司）在9700型PCR扩增仪（美国AB公司）上扩增，反应体系10 μL，循环30次。扩增产物在3130XL遗传分析仪（美国AB公司）上电泳检测，使用GeneMapper ID v3.2.1分析数据，图谱峰高识别阈值为50RFU。

2 结果

对上述检验图谱进行统计，可以看出两种提取方法的提取产物经同样的扩增、检测，QIAcube纯化法所得结果要明显优于普通的Chelex-100法。按等位基因检出数的不同，统计结果见表1。

表1 两种提取方法的STR分型结果（等位基因检出数）［例（%）］

瓶口检材无论采用Chelex-100法还是QIAcube纯化法均有较高的检出率，尤其是使用QIAcube纯化法时有90.63%的检材可检出9个以上等位基因，且峰高基本在1000RFU以上，多为单一来源，仅有2例混合斑。未检出的3例均无瓶盖保护，推测DNA降解毁损严重。

工具手柄擦拭子与绳索衣物类检材使用Chelex-100法提取，检出率均不高，尤其是绳索衣物类检材使用脱落细胞粘取器粘取后直接用Chelex-100法提取时仅13.33%的检材可检出9个以上等位基因。使用QIAcube纯化法提取，两者的检出率均有明显提高，但峰高基本在2000RFU以下，而且来源复杂，多检出混合基因图谱。

3 讨论

Chelex-100是一种由苯乙烯和二乙烯基苯共聚体组成的化学螯合树脂，可以螯合多价金属离子，尤其是选择性螯合二价离子（如镁离子），使体系中降解DNA的核酸酶失活，从而保护DNA分子。Chelex-100法提取DNA，在同一管中操作，因此检材的损失率低，相对不容易污染，操作简便快速，价格低廉，对试剂设备的要求低，广泛适用于常规物证的DNA提取[1]。杨电等[2]用小体积Chelex-100法提取微量口腔脱落细胞检材DNA进行STR分型，9个以上STR位点分型成功率在60%左右，与笔者使用Chelex-100法提取瓶口56.25%的成功率相当。但此方法将DNA检材的载体、核膜及其他试剂一起保留在同一离心管中，不能有效去除杂质，降低了DNA的纯度，可能抑制下游的PCR扩增，从而导致检出率下降。畅晶晶等[3]分别采用6种不同的方法提取全血DNA，通过试验证明常规Chelex-100法所得DNA模板的纯度较低。因此Chelex-100法通常只适用于污染轻、杂质少、DNA含量高、载体体积小的常规检材的DNA提取，而在污染、腐败、微量检材的处理上存在很大的局限性。如笔者使用该方法处理工具手柄及绳索衣物类检材时，检出率较低，分别为33.33%、13.33%，明显低于QIAcube纯化法的72.22%、80.00%。

QIAamp DNA Investigator试剂盒使用的MinE-lute离心柱，上面的硅胶膜既能与DNA硅胶膜特异性结合，又能滤去大颗粒杂质与可溶性PCR抵制物，最后使用小体积ATE缓冲液洗脱，得到不含蛋白质、核酸酶和抑制剂的DNA浓缩液，有利于下游的PCR扩增。QIAcube核酸自动化提取仪将上述裂解、结合、清洗、洗脱操作流程实现标准化、封闭化、全自动化，避免人为操作带来的误差、污染等问题，使DNA检验快速、准确、可重复。从DNA提取的原理来看，QIAcube纯化法能更有效地释放DNA，而且可以有效去除模板DNA中的杂质，同时兼具浓缩富集功能，因而可以获得更纯、浓度更高的DNA模板。从实际检验效果来看，使用该方法提取DNA不仅检出率明显高于Chelex-100法，而且其图谱峰高也明显高于Chelex-100法。此外，对于纯化过的微量DNA样本，通常使用小体系平行扩增同时适当增加循环次数来提高其检测的灵敏度[4]，但同时也会伴随着等位基因插入、等位基因丢失、stutter产物增加等问题，需要谨慎判别图谱。

[1]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京：中国人民公安大学出版社，2002：38-39.

[2]杨电，刘超，徐曲毅，等.微量口腔脱落细胞检材的DNA检验[J].法医学杂志，2008，24（2）：126-128.

[3]畅晶晶，张素华，李莉.全血中DNA 6种提取方法的比较[J].法医学杂志，2009，25（2）：109-111，114.

[4]张璐，王保捷，丁梅，等.循环次数与体系对DNA检测灵敏度的影响[J].法医学杂志，2013，29（2）：125-126.

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.018

1004-5619（2015）02-0148-02

2013-12-18）

（本文编辑：李成涛）

廖长青（1982—），男，湖南怀化人，主检法医师，主要从事法医物证检验及鉴定工作；E-mail：35046786＠qq.com