大鼠呼吸机相关肺损伤自噬相关蛋白的表达及意义

大鼠呼吸机相关肺损伤自噬相关蛋白的表达及意义

刘东雷杨洋吴恺齐宇赵松

(郑州大学第一附属医院胸外科， 河南郑州450052)

摘要〔〕目的探讨大鼠呼吸机所致肺损伤(VILI)过程中自噬相关蛋白的表达及意义。方法健康雄性SPF级SD大鼠 30只，7周龄，体重(220±20)g，实施麻醉和气管切开术后分别接受不同潮气量(VT)的通气(通气时间均为4 h)。随机分为三组：对照组(A组，仅切开气管保留自主呼吸)；常规通气组(B组，VT=10 ml/kg)；损伤通气组(C组，VT=40 ml/kg)。A组在气管切开即刻，其他组在机械通气结束后放血处死动物，Western印迹检测肺组织Beclin1和 LC3的表达，计算肺湿/干比重(W/D比值)、MPO活性及肺泡灌洗液中总蛋白含量，光镜下行白细胞计数。结果在大潮气量机械通气4 h后，肺组织中总蛋白、W/D、白细胞计数和MPO等指标均显著增加(P<0.05)；肺组织中Beclin1、LC3表达水平(1.21±0.11、0.91±0.11)均显著增加。结论自噬表达的增加参与了大鼠VILI的发生。

关键词〔〕呼吸机相关肺损伤；自噬；肺

中图分类号〔〕R563〔

基金项目：河南省教育厅科学技术重点研究项目(No.14A320076)；郑州大学第一附属医院青年创新基金

通讯作者：赵松(1963-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事胸部肿瘤基础与临床研究。

第一作者：刘东雷(1982-)，男，主治医师，主要从事自噬与胸外科疾病的相关研究。

机械通气已经成为抢救急危重症病人治疗的重要措施之一，但由于呼吸机使用不当或使用时间过长引起的肺损伤，即呼吸机所致肺损伤(VILI)已成为机械通气最严重的并发症之一，若不及时处理可导致患者死亡〔1〕。本研究应用大潮气量(VT)机械通气建立大鼠VILI模型，观察VILI时自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达，探讨其在VILI中过程中的意义。

1材料与方法

1.1实验动物与试剂健康雄性SPF级SD大鼠30只，7周龄，体重(220±20)g(河南省实验动物中心提供)。Bcelin1和LC3抗体购自Santa Cruz公司，β-actin抗体购自Sigma公司。总蛋白和髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其他试剂均购自Sigma公司。

1.2模型复制与分组30只大鼠随机分为三组，每组10只。A组为对照组，仅行气管切开保留自主呼吸；B组为常规通气组，机械通气条件为VT 10 ml/kg，呼吸频率(RR)40次/min，氧体积分数(FiO2)40%；C组为损伤通气组，机械通气条件为VT 40 ml/kg，RR 40次/min，FiO240%。B组和C组的通气时间均为4 h。实验前12 h禁食，自由饮水。10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，气管切开后插入器官导管行机械通气，参数设置I∶E为1∶3，呼气末正压(PEEP)为零。实验过程中静脉给予阿曲库铵维持肌松，并行皮下切开股静脉穿刺置管。A组在气管切开即刻，其余各组在机械通气结束时立即颈动脉放血处死动物。

1.3标本采集及检测大鼠处死后立即开胸小心分离两侧肺组织，取右下肺同一部位(约200 mg)立即投入液氮中保存，其余部位的肺组织称肺湿重，然后置于37℃干燥箱中烤至恒重后称干重，计算肺湿/干比重(W/D)。左肺用生理盐水行肺灌洗，回收后1 500 r/min离心10 min，沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后行瑞氏染色，光镜下行白细胞(WBC)计数。支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白的测定采用考马斯亮蓝染色，肺组织MPO活性测定采用MPO试剂盒。肺组织中Beclin1和LC3蛋白的表达采用Western印迹法，以β-actin作为标准内对照，图像应用TotalLab2.0软件进行灰度分析。

2结果

2.1肺W/D比值、BALF中总蛋白和白细胞计数及MPO含量的比较与A组相比，B组肺组织总蛋白、W/D、WBC和MPO等各项指标的变化均无统计学意义(P>0.05)；与B组相比，C组肺组织总蛋白、W/D、WBC和MPO等各项指标均显著增加(P<0.05)。见表1。

2.2肺组织Beclin1和LC3的蛋白表达变化A、B、C三组肺组织中Beclin1蛋白表达的相对灰度值分别为0.67±0.05、0.72±0.06、1.12±0.14，LC3为0.52±0.07、0.58±0.08、0.91±0.11。Beclin1和LC3表达C组均显著高于A、B组(P<0.05)。

检测指标A组B组C组W/D3.14±0.233.27±0.286.13±0.371)总蛋白(g/ml)0.42±0.060.37±0.074.12±0.291)WBC(×106/L)2.45±0.272.37±0.395.89±0.751)MPO(U/g)2.98±0.783.05±0.986.75±1.181)

与A、B组相比：1)P<0.05

3讨论

机械通气是临床上常用的治疗急性肺损伤的方法，但若使用不当也可导致肺损伤加重。VILI病理学特征主要是肺泡毛细血管通透性增加进而导致肺间质水肿及炎性细胞渗出〔2〕。肺组织W/D的变化可反映肺间质水肿改变的程度。MPO是中性粒细胞释放的一种过氧化物酶类，可反映肺组织中性粒细胞水平的高低；肺泡灌洗液中WBC计数可反映WBC的浸润水平。本研究结果显示，大潮气量机械通气诱导的肺组织损伤与肺组织炎性反应有关。

细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，能够通过溶酶体途径进行降解以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新〔3〕。已有研究表明细胞自噬与炎症反应之间存在一定程度的关联〔4〕，在一定条件下自噬能够减轻细胞炎症反应。LC3和Beclin1是自噬过程中重要的标志性分子。Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因，在自噬溶酶体形成的过程中发挥重要作用〔5〕。LC3是哺乳动物细胞中酵母ATG8的同源物，主要定位于前自噬泡和自噬泡膜的表面，其含量的多少与自噬泡数量多少呈正比，因此LC3蛋白的多少是自噬检测的重要指标之一〔6〕。本结果提示，在大鼠VILI的过程中，自噬相关蛋白参与了大鼠呼吸机相关性肺损伤的发生，与Hussain等〔7〕结果一致。

4参考文献

1Slutsky AS,Ranieri VM.Ventilator-induced lung injury〔J〕. N Engl J Med,2013;369(22):2126-36.

2Carney D,DiRocco J,Nieman G. Dynamic alveolar mechanics and ventilator-induced lung injury〔J〕. Crit Care Med,2005;33(3-1):122-8.

3Reddy SP,Hassoun PM,Brower R. Redox imbalance and ventilator-induced lung injury〔J〕. Antioxid Redox Signal,2007;9(11):2003-12.

4Arroyo DS,Gaviglio EA,Peralta-Ramos JM,etal.Autophagy in inflammation,infection,neurodegeneration and cancer〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;18(1):55-65.

5Deretic V,Saitoh T,Akira S.Autophagy in infection,inflammation and immunity〔J〕. Nat Rev Immunol,2013;13(10):722-37.

6Klionsky DJ,Abdalla FC,Abeliovich H,etal.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy〔J〕. Autophagy,2012;8(4):445-54.

7Hussain SN,Mofarrahi M,Sigala I,etal. Mechanical ventilation- induced diaphragm disuse in humans triggers autophagy〔J〕. Am J Respir Crit Care Med,2010;182(11):1377-86.

〔2013-03-18修回〕

(编辑袁左鸣)