NF-κB参与银杏叶提取物保护血管内皮细胞的作用

NF-κB参与银杏叶提取物保护血管内皮细胞的作用

赵外欧李相军1

(吉林大学第一医院心血管中心，吉林长春130021)

摘要〔〕目的阐明银杏叶提取物(GBE)对H2O2介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用。方法HUVEC分为对照组、H2O2处理组、50 mg/L及100 mg/L GBE处理组。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力。Western印迹分析各组细胞(NF-κB P65)表达。结果H2O2处理组细胞增殖率明显低于对照组(P<0.01)；GBE高、低剂量组细胞增殖能力明显高于H2O2处理组(P<0.01，P<0.05)。各组细胞细胞核NF-κB P65表达量差异有显著性，与H2O2处理组比较，GBE高、低剂量组NF-κB P65核/浆比明显升高(P<0.01)。结论GBE通过NF-κB通路影响血管内皮细胞的增殖能力。

关键词〔〕银杏叶提取物；血管内皮细胞；NF-κB；细胞增殖

中图分类号〔〕R285〔

通讯作者：李相军(1974-)，男，医学博士，讲师，主要从事心血管药理研究。

1吉林大学药学院实验药理与毒理教研室

第一作者：赵外欧(1971-)，男，硕士，主治医师，主要从事冠心病基础研究。

银杏叶提取物(GBE)已被广泛应用于心、脑血管疾病的预防和治疗〔1，2〕。NF-κB作为调控DNA转录的核蛋白因子，广泛存在于多种细胞内，参与炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等病理生理过程的基因调控，研究表明NF-κB 在血管内皮细胞氧化应激过程中发挥重要调控作用〔3，4〕。GBE药理作用广泛，有研究表明，GBE有保护血管内皮细胞作用〔5〕，但其机制尚不清楚。本研究旨在通过利用H2O2介导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤模型，探讨GBE在此过程中对内皮细胞的保护作用，同时探讨NF-κB在其中的作用。

1材料与方法

1.1细胞株及主要试剂HUVEC细胞株为本实验室保留。GBE，商品名为金纳多，购自德国威玛舒培博士大药厂。DMEM培养基及新生牛血清购自Hyclone公司。NF-κBp65(F-6)(SC-8008)购自SantaCruz Biotechnology，HRP标记的山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)购自北京中杉金桥公司。化学发光试剂盒(ECL)为美国Millipore公司产品。细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0013B)为广东碧云天生物技术公司产品。

1.2实验分组HUVEC细胞株经常规复苏、传代培养至对数期后，按下述条件分为4组，对照组、H2O2处理组、50 mg/L(低剂量)及100 mg/L(高剂量)GBE组。其中正常对照组用无血清DMEM培养基培养；H2O2处理组用含500 μmol/L H2O2的无血清培养基培养；50 mg/L及100 mg/L GBE处理组在H2O2处理组所用培养基基础上加入GBE至终浓度分别为50 mg/L和100 mg/L。各组细胞换用上述条件培养液之前，先用无血清培养液预处理12 h，以使HUVEC生长同步化。HUVEC常规传代培养用含10%新生牛血清的DMEM培养基，在37℃ 5% CO2条件下培养。

1.3细胞增殖能力测定采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法。将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中继续培养24 h，接种密度为1×103/孔，待细胞完全贴壁后，换用无血清培养基继续培养12 h以同步化细胞生长，然后换用上述条件培养基继续培养24 h，第2天，向每孔中加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，3 h后，弃去培养上清，加入150 μl 二甲基亚砜(DMSO)以溶解沉淀，于490 nm处用酶标仪测定各孔吸光度值(OD)。计算各组细胞增殖率。每组设5个复孔，重复3次。

1.4细胞核蛋白与细胞质蛋白的抽提核质总蛋白提取主要操作步骤：将贴壁生长的HUVEC用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗1遍，用细胞刮子刮下细胞，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，每20 μl细胞沉淀加入200 μl添加了PMSF的细胞质蛋白抽提试剂A。剧烈涡旋振荡5 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开，冰浴10～15 min。再加入细胞质蛋白抽提试剂B 10 μl，剧烈涡旋振荡5 s，冰浴1 min。4℃ 12 000 r/min离心5 min，上清为抽提得到的细胞质蛋白。对于沉淀，加入50 μl添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂，剧烈涡旋振荡5 s，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1～2 min再剧烈涡旋振荡15～30 s，共30 min。4℃ 12 000 r/min离心10 min，上清为抽提得到的细胞核蛋白。

1.5Western印迹分析用Western印迹分析各组培养细胞胞浆与胞核中NF-κBp65表达情况。采用Bradford法测定各样本总蛋白浓度。将蛋白样品30 μg与上样缓冲液混匀，加热、变性后按标准程序进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜。将蛋白膜漂洗后加入5%脱脂奶粉封闭液，再加入适当比例(1∶200)稀释的NF-κB，4℃孵育过夜。TBST洗液洗膜3次，5 min/次，立即加入稀释好的HRP标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h。TBST洗液洗膜3次，5 min/次。用ECL发光显色试剂盒显色，显影、定影，扫描底片后用Image J软件分析条光密度。以比较细胞核及细胞质NF-κB条带密度，分析NF-κB在各组细胞中的变化情况。

2结果

2.1MTT结果以对照组细胞活力为100%，H2O2处理组细胞增殖率为73.91%(73.91%±8.77%)，明显低于对照组(P<0.01)。GBE高、低剂量组细胞增殖能力〔(94.43±10.81)%、(87.29±8.34)%〕明显高于H2O2组〔(73.91±8.77)%〕(P<0.01、P<0.05)。

2.2Western印迹结果各组细胞胞质中NF-κB p65表达量差异无显著性，而各组细胞NF-κB P65在细胞核中表达量差异有显著性。H2O2处理组NF-κB P65核/质比值(0.78±0.21)与对照组(1.99±0.40)比较差异显著(P<0.05)。与H2O2处理组比较，GBE高、低剂量组(1.55±0.31,1.43±0.19)明显升高(P<0.01)，见图1。

1～4：对照组、H 2O 2处理组、GBE高、低剂量组 图1　各组细胞细胞质及细胞核NF-κB P65表达

3讨论

H2O2是体内常见的一种活性氧，作为氧化应激反应的伴随产物，可促进自由基生成。H2O2很易穿透细胞膜到达胞内改变细胞内生理微环境，因此积累到一定程度会造成细胞损伤〔6〕。血管内皮细胞的损伤是多种血管性病变的主要环节，保护血管内皮功能成为防治血管性疾病的关键环节。H2O2引起细胞损伤的浓度各有不同〔7，8〕，本研究表明用500 μmol/L H2O2能够抑制HUVEC增殖。

NF-κB是一种核蛋白因子，广泛存在于多种细胞内，参与炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等病理生理过程的基因调控。静息状态下，NF-κB以p50/p65 二聚体形式存在于细胞质内，抑制性蛋白(IκB)结合，结合状态下NF-κB没有活性。当存在病毒、氧化剂、炎症细胞因子等刺激时，IκB被IκBa激酶等蛋白激酶激活而降解，随之NF-κB即被释放激活，解离后的p50/p65转移至核内，与基因启动子上的κB序列结合，启动有关基因的表达与调控〔9〕。NF-κB蛋白本身存在于胞质中，所以由其调控免疫反应更快捷有效，因此NF-κB被认为是控制早期基因表达的基因开关〔10〕。本研究提示H2O2对HUVEC的抑增殖作用与降低NF-κB P65迁移入核、进而抑制转录有关。GBE可显著增加由H2O2介导HUVEC损伤细胞核NF-κB P65表达量，提高核质比例，增加细胞转录活性，刺激HUVEC操作修复，细胞增殖，从而实现对HUVEC的保护作用。

4参考文献

1Oyama Y，Ueha T，Hayashi A，etal.Flowcytometric estimation of the effect of Ginkgo biloba extract on the content of hydrogen peroxide in dissociated mammalian brain neurons〔J〕.Jpn J Pharmacol,1992;60(4)：385-8.

2Ou HC1，Hsieh YL，Yang NC，etal.Ginkgo biloba extract attenuates oxLDL-induced endothelial dysfunction via an AMPK-dependent mechanism〔J〕.J Appl Physiol (1985)，2013；114(2)：274-85.

3Park YJ，Kim MJ，Kim HR，etal.Chemopreventive effects of Ginkgo biloba extract in estrogen-negative human breast cancer cells〔J〕.Arch Pharm Res，2013;36(1)：102-8.

4González-Ramos R，Defrère S，Devoto L.Nuclear factor-kappaB：a main regulator of inflammation and cell survival in endometriosis pathophysiology〔J〕.Fertil Steril，2012;98(3)：520-8.

5Zhang J，Li Y，Yu M，etal.Lineage-dependent NF-kappaB activation contributes to the resistance of human macrophages to apoptosis〔J〕.Hematol J，2003;4(4)：277-84.

6Ryter SW，Kim HP，Hoetzel A，etal.Mechanisms of cell death in oxidative stress〔J〕.Antioxid Redox Signal，2007;9(1)：49-89.

7Xie J，Zhou X，Hu X，etal.H2O2evokes injury of cardiomyocytes through upregulating HMGB1〔J〕.Hellenic J Cardiol，2014;55(2)：101-6.

8Nishimoto T，Matsumoto A，Kihara T，etal.Protective effect of H2O2against subsequent H2O2-induced cytotoxicity involves activation of the PI3K-Akt signaling pathway〔J〕.Cell Mol Biol (Noisy-le-grand)，2010;56(Suppl)：OL1447-52.

9Verhelst K，Verstrepen L，Carpentier I，etal.IκB kinase ε (IKKε)：a therapeutic target in inflammation and cancer〔J〕.Biochem Pharmacol，2013；85(7)：873-80.

10Oeckinghaus A，Ghosh S.The NF-kappaB family of transcription factors and its regulation〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2009;1(4)：a000034.

〔2013-11-04修回〕

(编辑徐杰)