β-半乳糖苷酶选择性催化人参皂苷Rg3水解制备Rh2初探*

万会达，李丹，张珏

1(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，化学与材料工程学院，江苏无锡，214122)

2(江苏省原子医学研究所，江苏 无锡，214063)

人参皂苷是人参(Panax ginseng)中一类提高免疫力，抗疲劳，抗肿瘤的活性物质，目前已经分离和鉴定出超过100种的人参皂苷［1-2］。人参皂苷类物质均具有17个碳原子排列成4个环的甾烷类固醇苷元，在苷元上连接不同种类和数量的糖基，形成具有各种理化性能的人参皂苷。构效关系研究表明，主要人参皂苷(Rb1，Rg1，Re等)的代谢水解产物，通常被称为次级苷，具有更高的生物利用度和药理活性。如人参皂苷Rh2为Rg3水解一个葡萄糖基所得的次级苷(式1)，其生物利用度明显强于Rg3［3］。在自然界中由于次级苷含量稀少，因而已经有多种方法用于稀有次级苷的制备，例如化学法，生物酶催化法，微生物转化法等［4-6］。人参皂苷中多个糖苷键均有可能被水解，而生物酶催化法具有高选择性，反应条件简单温和等特质，成为目前次级苷制备研究的主要方向之一［7-9］。β-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galactohydrolase，β-galactosidase，EC 3.2.1.23)是一种常见的 β-糖苷水解酶，可以催化乳糖水解和转苷两种反应，已经在食品加工、乳品饮料、生物医药制造等领域中广泛应用［10-11］。不同来源的 β-糖苷水解酶同时具有多种催化活性，如水解β-半乳糖苷键、β-葡萄糖苷键、β-果糖苷键等。此外，大多数人参皂苷水溶性差，如Rg3在水中几乎不溶(＜0.02 mg/mL)，成为制约水相酶催化制备次级苷的“瓶颈”。化学修饰可以提高人参皂苷的溶解性，但分子结构发生变化;加入甲醇等有机溶剂助溶无疑会导致酶失活。羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)包合法能够提高包括人参皂苷在内的多种疏水性物质的溶解度，且无毒副作用，已经被FDA批准可以用于食品和医药等领域中［12-13］。本文尝试先包合Rg3，后以来源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解的方法制备Rh2，初探了加酶量、反应时间、底物对水解反应的影响(式1)。

式1 β-半乳糖苷酶选择性催化水解Rg3制备Rh2Scheme 1 Transformation pathway from ginsenoside Rg3 to Rh2 using β-galactosidase

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

β-半乳糖苷酶(来源于Aspergillus sp.)由江南大学吴敬教授课题组提供;人参皂苷 Rg3-30粗品(30%，HPLC)由抚松县大自然生物有限公司惠赠;人参皂苷Rg3-90(S型，≥90%，HPLC)，人参皂苷标准物Rg3-98和Rh2-98(S型，≥98%，HPLC)购于江苏泽朗生物医药有限公司;羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD，1 522.6 g/mol)购于山东淄博千汇生物科技有限公司;邻硝基苯酚(oNP，99%)和对硝基苯酚(pNP，99%GC)购于上海晶纯生化科技股份有限公司;对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG，98%)，邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG，99%)，购于上海宝曼生物科技有限公司;乙腈(色谱纯)，购于美国J.T.Baker公司;其他化学试剂(AR)购于国药集团化学试剂有限公司。

紫外可见分光光度计(T6新世纪)，北京普析通用仪器有限公司;往复式水浴摇床(HZ-8812S-B)，太仓市华利达实验设备有限公司;超级恒温水槽(DKB-501A)，上海森信实验仪器有限公司;液相色谱仪(2695，二极管阵列检测器996)和液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪(MALDI SYNAPT QTof MS)，美国Waters公司;场发射扫描电子显微镜(SEM，S-4800)，日立公司。

1.2 方法

1.2.1 β-半乳糖苷酶酶活测定

oNPG水解酶活测定:依次在5 mL离心管中加入1.8 mL醋酸缓冲液(pH 4.6);再加入100 μL稀释数倍的酶液(空白不加酶)，37℃下预热10 min，加入oNPG(20 mmol/L)底物100 μL，计时反应10 min;加入1 mL Na2CO3(1 mol/L)终止反应;在420 nm处测定其吸光度，根据邻硝基苯酚oNP标准曲线(y=0.229 2×OD值，R2=0.999 2)计算酶活。

pNPG水解酶活测定:依次在5 mL离心管中加入1.8 mL醋酸缓冲液(pH 4.6);再加入100 μL稀释数倍的酶液(空白不加酶)，37℃下预热10 min，加入pNPG(20 mmol/L)底物100 μL，计时反应10 min;加入1 mL Na2CO3(1 mol/L)终止反应;在405 nm处测定其吸光度，根据对硝基苯酚pNP标准曲线(y=0.058 3×OD值，R2=0.999 8)计算酶活。

酶活(U)定义为:在上述反应条件下每分钟生成1 μmol oNP或pNP所需要的酶量(g)。

1.2.2 Rg3 相溶解度曲线［14］

根据Higuchi和Connors提出的相溶解度法测定Rg3的相溶解度曲线:配制不同浓度的HP-β-CD水溶液，分别加入过量的Rg3-98，然后在一定温度下(45℃，55℃或65℃)充分振荡平衡24 h;离心取上清液，HPLC外标法测定Rg3的浓度;以HP-β-CD浓度为横坐标，Rg3浓度为纵坐标，绘制相溶解度图，根据相溶解度曲线的回归方程可得曲线的斜率。

1.2.3 Rg3 包合物制备［15］

配制HP-β-CD(200 mg/mL)水溶液，60℃下恒温;将20 mg/mL Rg3-90逐滴加入到 HP-β-CD溶液中;持续搅拌2 h后再在25℃下搅拌3 h;在70℃下真空干燥即可得Rg3包合物。计算Rg3的回收率和包合率。同样方法制备Rg3-30粗品的包合物。

1.2.4 包合物表征

场发射扫描电子显微镜观察包合前后样品的形貌，加速电压1.0 kV，真空状态下喷金1 min;HPLC含量测定:Waters 2695，二极管阵列检测器(waters 996)，检测波长 205 nm;C18柱(Lichrospher C18，4.6 mm×250 mm，5 μm);梯度洗脱75%乙腈水溶液(0 min)到50%乙腈水溶液(25 min);流速1 mL/min。

1.2.5 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3水解反应

配制25 mg/mL的Rg3-90包合物溶液，在60℃下恒温0.5 h;加入来源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶(250 U/g Rg3，500 U/g Rg3)并计时反应，定时取样进行HPLC分析;反应结束后，对反应液进行LC-MS分析:色谱条件为BEH HILIC色谱柱，柱温为30℃，流速为0.3 mL/min，梯度洗脱30%乙腈水溶液(0 min)，100%乙腈水溶液(11～13 min)，30%乙腈水溶液(13.1 min)，进样量1 μL，进样浓度为1 mg/mL;质谱条件为碰撞电压6 eV;离子化方式电喷雾电离(ESI)，负离子检测模式，分子质量范围200～2 000)。

以Rg3-30为底物时，包合物浓度为100 mg/mL，其他条件同上。

2 结果与讨论

2.1 Rg3包合物的制备

来源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶直接催化水解Rg3时，未检测出有产物生成，推测是由于Rg3在水中的溶解度低导致，25℃时仅为0.017 mg/mL;虽然甲醇能助溶，但β-半乳糖苷酶失活，仍无产物生成。所以首先采用包合法提高Rg3溶解度，然后再进行水相酶催化反应。选用的包合剂为HP-β-CD，Rg3包合物收率为88.2%，Rg3含量为2.45%。图1a为Rg3的扫描电镜图;由图1b和图1d可知HP-β-CD具有球状孔隙结构，Rg3包合之后呈现较大的片状结构，均不同包合之前的形貌;图1c为二者物理混合物(水溶性并没有明显提高)的SEM，HP-β-CD的球状孔隙结构仍然存在，因而推测Rg3包合物已经制备得到。

25℃下的溶解度实验表明包合后，Rg3在水中的溶解度至少提高74.6倍，达到1.2 mg/mL。根据Higuchi和Connors提出的相溶解度法测定Rg3的相溶解度曲线，随HP-β-CD浓度增加，被包合的Rg3浓度也成线性增加(图2)。根据分类，可知Rg3的包合类型属于典型的AL型，并且Rg3与HP-β-CD之间形成了1∶1的包合物。

图1 Rg3(a)，HP-β-CD(b)，HP-β-CD/Rg3 物理混合物(50∶1 w/w)(c)，Rg3/HP-β-CD 包合物(d)的 SEMFig.1 SEM micrographs of Rg3(a)，HP-β-CD(b)，HP-β-CD and Rg3 physical mixture(50∶1 mass ratio)(c)and Rg3/HP-β-CD complex(d)

图2 Rg3的相溶解度曲线Fig.2 Phase solubility curve of Rg3

2.2 来源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解Rg3

测得来源于 Aspergillus sp.的 β-半乳糖苷酶的oNPG水解酶活为14 U/g，而pNPG水解酶活为6 540 U/g。以Rg3-90包合物为底物，考查β-半乳糖苷酶催化Rg3水解的反应。由图3可知只有一个产物生成，并且其与Rh2-98标准物的保留时间相同，结合质谱信息(m/z:829.6，［MRg3+COOH］-;m/z:783.6，［MRg3-H］-;m/z:667.5，［MRh2+COOH］-)，确定产物为Rh2。说明HP-β-CD包合并未阻断水解反应，来源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶能够选择性催化水解Rg3中的β-1，2糖苷键，不会进一步水解水解苷元与槐糖基之间的糖苷键而得到原人参二醇。

图3 Rg3水解过程取样的LC-MSFig.3 LC-MS profiles of Rg3 hydrolysis reaction

60℃下考查加酶量和反应时间对水解反应的影响，加酶量按照oNPG水解酶活加入，Rg3-90包合物浓度为25 mg/mL。由图4可知，反应24 h左右达到平衡。当加酶量提高1倍，初始反应速率加快，并且Rg3转化率和Rh2产率均提高1.6倍，Rg3的转化率达90.6%，Rh2的产率为88.5%。文献报道来源于Fusarium proliferatum ECU2042的β-葡萄糖苷酶(Rg3的转化率为60%)和来源于 Esteya vermicola CNU 120806的粗酶液(Rg3的转化率为90%，未提及产率)同样可以催化Rg3变成Rh2，但生物酶来源不常见，且忽视Rg3的溶解性问题［16-17］。

图4 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3-90的进程Fig.4 Time course of enzymatic transformation of Rg3

市售Rg3纯度不高，还含有多种人参皂苷。选取Rg3-30粗品，同样先包合后在60℃下β-半乳糖苷酶催化Rg3-30包合物(100 mg/mL)水解。经包合后，Rg3-30溶解度提高了65倍，说明除Rg3以外的人参皂苷也可以与HP-β-CD发生包合。由图5可知，结合标准品的HPLC，Rg3(16.87 min)水解生成Rh2(23.12 min)，反应后期Rh2会以沉淀形式析出(图5e)。此外还发现18.96 min和19.21 min对应的人参皂苷未知物未发生变化，19.96 min和20.39 min对应的人参皂苷未知物反应前后峰面积减少，说明在β-半乳糖苷酶作用下也发生了反应。因此需要进一步以高纯度人参皂苷为底物并结合各种表征手段，继续考查来源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解制备其他次级苷的性能。

图5 β-半乳糖苷酶催化水解Rg3-30的HPLCFig.5 HPLC profiles of Rg3-30 hydrolysis reaction

3 结论

本文先用羟丙基-β-环糊精包合Rg3，Rg3在水中的溶解度提高了74.6倍，包合属于AL型，形成1∶1的包合物。然后以Rg3包合物为底物，初探了来源于Aspergillus sp.的 β-半乳糖苷酶催化水解制备Rh2。当加酶量为500 U/g Rg3，60℃下反应24 h，Rg3的转化率达90.6%，Rh2的产率为88.5%。本文提供了一种新的高效制备Rh2的方法。

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