内窥镜法猪克隆胚胎移植研究

窦红伟，郑 华，田家宁，夏代刚，蒙小云，李 勇，石 伟

（1. 深圳市农牧实业有限公司，广东 深圳 518023；2. 深圳华大方舟生物技术有限公司，广东 深圳 518083）

内窥镜法猪克隆胚胎移植研究

窦红伟2，郑 华1*，田家宁2，夏代刚1，蒙小云1，李 勇2，石 伟1

（1. 深圳市农牧实业有限公司，广东 深圳 518023；2. 深圳华大方舟生物技术有限公司，广东 深圳 518083）

传统的手术法开展猪克隆胚胎移植会使受体母猪的创伤比较大，术后恢复慢和容易伤口感染等会影响克隆胚胎着床，从而影响移植成功率；同时，受体利用率低。为摸索新的猪克隆胚胎移植方法，和提高受体在胚胎移植中的利用次数，降低受体手术应激，应用内窥镜开展了20头猪克隆胚胎移植试验，结果分娩1头（4头活仔），移植成功率仅为5%。研究表明，内窥镜法开展猪克隆胚胎移植是可行的，但还需要继续摸索总结，才能提升移植成功率，熟练和标准化操作是内窥镜移植能否成功的关键。

克隆；猪胚胎移植；内窥镜

目前猪克隆胚胎移植的主流方法是手术法[1]。传统的手术法开展猪克隆胚胎移植会使受体母猪的创伤比较大，术后恢复慢，容易伤口感染，从而影响克隆胚胎着床和移植成功率。借鉴克隆羊技术[2]，内窥镜法进行猪克隆的胚胎移植是值得尝试的。内窥镜法属于微创手术，切口很小，只需在腹部切开1 cm左右的2～3个小口，将腹腔镜插入腹腔，在腹腔镜引导下，将胚胎植入子宫。这种方法虽然仍需要麻醉和类似于常规手术的程序，但由于手术切口小，切口恢复快，术后反应轻，出血肿胀时间可大大减少，不但降低了手术的感染概率，对受体母猪损伤和应激亦小得多，故可增加手术的精确性及安全性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

腹腔内窥镜、显示器、气腹机、冷光源、CO2气体、受体母猪、培育好的克隆胚胎数枚、无菌操作实验室、手术台、手术麻醉剂、氧气、笑气及呼吸麻醉机系统一套、手术刀、缝合针线等。要求试验母猪单独饲养，术前彻底清洁消毒；移植的胚胎要求发育良好，严格按照恒温38.5 ℃条件保存；手术前对手术室进行24 h紫外线照射处理；对参与手术的人员手术前做好消毒净化工作；手术所用的刀具、耗材做好消毒无菌工作，确保胚胎移植过程处于无菌操作。

1.2 试验方法

1.2.1 供体细胞建系及选择

1.2.1.1 供体的选择

在本试验开始前，根据我公司种猪群育种数据选择遗传指数高的，生产性能好的公猪作为此次试验的供体。

1.2.1.2 组织样品采集

保定好供体，采样人员对供体耳缘周边进行消毒清理，剃掉皮肤上层的绒毛，用采样器剪取0.5 cm×0.5 cm的耳肉，装入样品管，放入专用冷冻箱低温（4 ℃)保存，运回实验室进行细胞建系。

1.2.1.3 细胞建系

将采好的耳缘组织样品送至深圳华大方舟生物技术有限公司进行细胞建系，并传代培养和超低温液氮冻存。

1.2.1.4 克隆胚胎构建

将所建细胞系传至P5～P6，利用手工克隆技术进行克隆胚胎的构建，并且体外培养至第6天，发育至囊胚。用于移植的胚胎，挑选原则是尽量选取形态良好、扩张充分、内细胞团明显的囊胚。

1.2.2 胚胎受体的选择

胚胎受体的选择标准：分娩过程长短正常、异常仔猪少、产后恢复快、未有子宫炎症状及奶水好的母猪，同时选择断奶发情要在7 d以内的母猪，而且发情表现要很明显，本试验由于研究经费的限制和减小对试验场生产冲击，对受体母猪的选择没有严格执行这些标准，而是选取了一些断奶较长时间发情、空怀、返情和后备母猪。

1.2.3 移植时间

1.2.3.1 受体断奶时间

在确定了手术移植时间后，反推母猪断奶时间，即手术时间反推5 d为发情日期，发情日期反推6 d为断奶日期。

1.2.3.2 移植胚胎的胚龄

经过手工克隆重构胚，为发育至6 d的囊胚。

1.2.4 手术前的准备工作

1.2.4.1 移植胚胎的准备

用专门的捡胚器对拟移植的胚胎进行分捡并装入麦管，每头受体母猪准备2个麦管，每个麦管大约装入30枚胚胎。将装好胚胎的麦管放入恒温的运输箱。

1.2.4.2 受体母猪

发情后对受体母猪实行单栏饲养，术前做好清洗及消毒工作，手术前12 h禁食。

1.2.4.3 手术仪器准备和检查

准备手术器械、高压蒸汽锅、手术服、外科手术手套、口罩、缝线、洞巾、磺胺、生理盐水、碘酊、酒精、酒精棉、纸巾、消毒纱布。对所有进入手术室的器材都要进行灭菌处理。首先确定手术需要几套灭菌器材，灭菌前用洗洁精清洗器材并用蒸馏水洗净，然后通过高压蒸汽锅进行高压高温灭菌；高压蒸汽锅在103.4 kPa（1.05 kg/cm2）蒸汽压下，温度达到121.3 ℃，维持15～20 min，即可达到灭菌的效果；已灭菌的物品做好标记，与未灭菌的物品分开保存，以免弄错。

1.2.5 猪克隆胚胎的移植手术

1.2.5.1 操作准备与消毒

1）把受体母猪赶到缓冲间，用套嘴钢丝绳保定，注射诱导麻醉剂复方兽用氯胺酮2 mL。

2）把受体猪抬到手术台上，用加新洁尔灭的清水清洗腹部，剃毛，擦干。

3）把受体猪套上呼吸面罩，打开氧气流量计开关到0.8 L/min（浮子小球浮动到刻度线），接着将异氟烷开到最大5%，最后打开笑气（N2O）流量计到0.5 L/min。

4）用75%酒精喷洒手术器械载台，用消毒纸巾擦干。

5）手术人员戴口罩和帽子，穿手术服，最后戴手术手套，注意穿戴规则和顺序，操作时切忌碰到手套的外面，防止污染。

6）用手术镊夹持碘酊消毒手术部位(由内往外，成螺旋状)，再喷洒75%酒精脱碘，然后用生理盐水冲洗，酒精和生理盐水的喷洒方法同碘酊消毒一样，由内往外，不能来回重复。最后用消毒纱布拭干微创手术部位及外围。

1.2.5.2 微创开刀

为了在受体母猪体内能够准确找到子宫部位，需要开3个小创口。首先用手术刀在肚脐附近割一个2 cm的创口，插入气腹针，手感穿过肌肉后的镂空感，马上停止，连上气腹机软管，慢慢加大腹压，直到加到最大，观察受体腹部变化，并叩打腹部，听声音并同时看气腹机的读数，如果进气的话，读数会不断增加。当读数达到4～5 L的时候，受体腹部会有明显的鼓起。

1.2.5.3 引入内窥镜

把光纤和光源连接起来，把内窥镜连线和成像仪连接起来，当受体腹部有明显鼓起时，拔下气腹针，插入穿刺器，同时把气腹机软管连接穿刺器上，拔出套管内的穿刺针，插入连接成像仪和光源的内窥镜，观察腹腔内部情况。把内窥镜镜头对准腹壁相应位置，插入另外2个穿刺器。

1.2.5.4 寻找输胚位置

穿刺器插好后，拔出穿刺针，插入2把抓取钳，内窥镜与抓取钳配合找到子宫角，并顺着子宫角用2把钳子交替夹持，找出卵巢，观察卵巢的排卵情况，可以剥开输卵管伞，观察后再把卵巢用输卵管伞包起来。找出宫管接合处，用抓取钳夹持子宫角，调整好输胚角度。

1.2.5.5 输胚

调整到最佳位置后，放开另一把抓取钳，并把16#钝性打孔针经穿刺器套管伸入腹腔，在宫管结合部打孔，避免在可见血管稠密处进针，将装有胚胎的注射针经该孔伸入子宫腔中，徐徐推入猪克隆胚胎。输胚完成后用止血钳夹持小孔一段时间，防止出血，另一侧子宫同上操作。

1.2.5.6 缝合

输胚结束后，放空腹腔内的气体，确保放空后拔下穿刺器套管，伤口撒上磺胺后缝合1～2针，手术即结束。

1.2.6 术后管理及观察

待受体母猪完全清醒后，单独饲养管理，视伤口愈合情况决定是否需要相应治疗。如恢复良好，按照配种后1个月母猪标准进行饲养管理，在28 d时通过B超进行查孕，确定受体是否怀孕。

2 结果与分析

表1 内窥镜法猪克隆胚胎移植试验结果

2013年5月15日至8月26日间，我们共开展了20头母猪的内窥镜法移植试验。从移植效果来看，18头受体母猪都返情。L12003504号母猪虽然没有返情但剖腹产时发现无仔，也没有死胎和木乃伊，应该是胚胎死亡后被吸收了。L9033714号母猪剖腹产4头活仔。内窥镜法胚胎移植20头母猪成功1头，分娩率达到5%（1头/20头），移植效果不甚理想。但既然有了1头受体母猪分娩，说明内窥镜法开展猪克隆胚胎移植是可行的，只是还需要继续摸索总结，才能提升移植成功率。

3 讨论

本研究尝试内窥镜法进行猪克隆胚胎移植，但移植成功率较低，究其原因在于受体母猪的选择。

3.1 受体母猪的选择

受体母猪因素对克隆猪生产效率的影响是显著的[3]。我们利用腹腔内窥镜开展克隆猪的胚胎移植，只是觉得原理上可行，抱着试试看的心态，为减少对猪场正常生产经营的影响，所以选取的受体母猪基本上都是繁殖异常母猪，其中有4头为返情母猪，7头为空怀母猪，1头为后备母猪，只有8头是断奶母猪，且基本是推迟发情的母猪。由于这些受体母猪本身繁殖异常，即便按正常程序配种，其受胎率和分娩率也可能不高，所以造成克隆成功率低。

3.2 内窥镜操作需要专业技能，熟练和规范操作是移植成功的关键

由于整个试验过程都是在视野狭窄的内窥镜下进行，操作难度大，力度、角度和位置没有掌握好，或者熟练度不高都会影响试验效果。譬如，内窥镜刚插入腹腔时，与腹腔温度有温差，如果不对镜头进行预热，会出现镜头结雾影响操作；插入另外2个穿刺器时，如果力量没有把握好，不注意腹壁情况，会扎穿腹壁伤到内脏；卵巢和子宫角的查找，会延长手术时间和造成伤害；子宫角打孔会造成穿孔或刺入子宫壁，造成胚胎损失和移植失败等等。熟能生巧，只有不断尝试和总结，提高操作技能，并不断将操作标准化，才能真正地提高胚胎移植成功率。

[1] 李旭阳，邳明伟，孙慧敏，等.克隆猪的胚胎移植技术及其应用[J].猪业科学，2006， 23（2）：10-12.

[2] 王申元，周欢敏，张立，等.不同处理方法对绵羊克隆胚胎的移植比较研究[J].黑龙江畜牧兽医，2010（1）：51-52.

[3] 卫恒习，李秋艳，高凤磊，等. 胚胎移植方法和受体母猪因素对克隆猪生产效率的影响[J]. 中国农业科学，2012，45(15)：3147-3153.

2014-11-13）

国家现代农业产业技术体系（编号：CARS-36）、深圳市科技计划项目（编号：JSA200904011807A）