单核细胞增生李斯特菌对秀丽隐杆线虫致病性的研究

郭欣欣， 于新惠， 张 颖， 罗 勤

(华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079)



单核细胞增生李斯特菌对秀丽隐杆线虫致病性的研究

郭欣欣， 于新惠， 张 颖， 罗 勤*

(华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079)

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是李斯特菌病的病原细菌。用Lm野生株EGDe、弱毒株ΔprfA、毒力回复株+prfA和高毒株+prfA*喂饲模式生物秀丽隐杆线虫N2，并以线虫的良好食源大肠埃希菌OP50以及非致病的无害李斯特菌(Listeriainnocua)作为对照，检测Lm对线虫发育周期、寿命和产卵数的影响。结果显示：当以无害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突变株为食时，线虫的产卵数虽有所下降，但线虫不仅能够正常产卵，而且其发育周期和寿命均较以OP50为食时显著延长(P≤0.05)；线虫体表和消化道中均可检测到大量李斯特菌，但粪便中的活菌数极少。以上结果说明Lm不能杀死秀丽隐杆线虫，对线虫也没有显著致病性，不适合作为研究Lm致病机制的模型；Lm可在线虫体表和消化道存在，暗示Lm可借助线虫在土壤环境中生存和传播。

单核细胞增生李斯特菌；秀丽隐杆线虫；PrfA；致病性；模型

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)是一种以细菌为食、自由生活的小型土壤线虫。因其具有全身透明易于观察、生命周期短、操作方便简单、培养成本低廉、可操控性强等优点，已成为应用越来越广泛的模式生物。用病原细菌喂饲线虫，如果病原菌可以对线虫致病，则线虫可能作为研究病原菌致病机制的模型。目前该方面的研究已成功用于发现或确定金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderiapseudomallei)等细菌的毒力因子[1]，鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)与宿主相互作用关系，以及耐药机制等多个方面。单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，以下简称Lm)是一种无芽胞兼性厌氧革兰阳性菌，在自然界中广泛分布, 土壤、污水、人和动物的粪便、饲料以及多种食品中均有该菌存在 。通过摄入被其污染的食物, 人和动物能罹患李斯特菌病(Listeriosis)，引起脑膜炎、骨髓炎、心肌炎、孕妇流产以及产褥感染等疾病，死亡率高达30%～70%，因此被世界卫生组织(WHO)列为关系食品卫生安全的重要的食源性致病菌之一。PrfA (Positive regulatory factor A) 是Lm中调控绝大多数毒力基因转录表达的重要毒力因子，在细菌侵染宿主并导致疾病中起着至关重要的作用，缺失其编码基因prfA将极大降低该菌的致病能力[2]。和其他病原细菌一样，Lm对秀丽隐杆线虫的致病能力也成为人们关注的焦点，然而迄今为止该方面的研究结果却争议巨大。一方面，Thomsen等[3]报道Lm能够在线虫肠道内积累并杀死线虫，而缺失了毒力因子PrfA 和DegU的突变株却不能杀死线虫，因此认为秀丽隐杆线虫可以作为研究Lm毒力因子的模型；另一方面，Guha等[4]却发现浮游状态和生物被膜状态的Lm均不能感染和杀死线虫，线虫不能成为研究Lm致病机制的模型。为了确证Lm对秀丽隐杆线虫的致病作用，利用本实验保存和构建的无害李斯特菌(Listeriainnocua)标准株CLIP 11262和Lm标准野生株EGDe以及该菌衍生的3种PrfA突变株喂饲秀丽隐杆线虫野生型N2，即：△prfA(缺失PrfA的编码基因prfA，菌株毒力极大减弱[2])、+prfA(高拷贝回复野生型prfA基因到△prfA中, 菌株毒力恢复)、+prfA*(回复prfA的突变基因prfA*到△prfA中，使其PrfA蛋白组成性高表达，菌株毒力极大增强)，比较观察线虫发育周期、寿命、产卵数以及线虫体表、消化道和粪便中细菌数的差异，从而探讨线虫是否适合作为研究Lm致病机制的模型。

1 材料与方法

1.1 线虫、细菌及培养条件

秀丽隐杆线虫野生型N2和大肠埃希菌 OP50由华中师范生命科学学院王国秀教授惠赠，OP50在NGM (Nematode growth medium)[5]液体培养中培养到OD600为0.6，取100 μL均匀涂布到NGM琼脂平板上，37 ℃培养至平板长满细菌后，转接线虫到平板上，25 ℃进行培养。无害李斯特菌标准株CLIP 11262以及单核细胞增生李斯特菌标准株EGDe由德国维尔茨堡大学Werner Goebel教授惠赠，EGDe衍生的3种PrfA突变株由本实验室构建和保存[6]，EGDe和△prfA 采用BHI (Brain Heart Infusion, B&D公司) 培养基培养；+prfA 和+prfA*在含有20 μL/mL红霉素的BHI培养基中培养。以上细菌在BHI液体培养中培养到OD600至0.6，取100 μL均匀涂布到BHI琼脂平板上，37 ℃培养至平板长满细菌后，转接线虫到平板上，25 ℃继续培养。

1.2 线虫的同步化

参照文献[5]进行：首先在生长有OP50的线虫NGM平板上大量培养线虫，用M9缓冲液将线虫冲于离心管中，清洗，加入裂解液。将裂解得到的虫卵置于无OP50的NGM培养基中孵化。将孵化得到的L1期线虫转移到有OP50的NGM培养基中继续培养，从而获得生长状态一致的同步化的线虫。

1.3 培养基和抗生素对线虫生存曲线和寿命的影响

分别将10条同步化的L4期线虫接入无菌、无抗生素的BHI平板或者添加20 μL/mL红霉素(Amresco公司)的BHI平板，以及无菌NGM平板上，25 ℃培养，若线虫对于触碰无反应则判断线虫死亡。每隔12 h观察线虫生活状况，记录存活线虫的数目，计算线虫存活率。以线虫的存活率为纵坐标，观察时间为横坐标作图，即为线虫的生存曲线。线虫寿命的测定方法见1.5, 喂饲菌苔为OP50，分别培养在BHI和NGM平板上。实验重复3次。

1.4 线虫发育周期的测定

方法参考Lin等[7]的报道，分别挑取10条同步化的L1期线虫于生长有待检细菌菌苔的平皿上，待卵产生后，收集大约20 颗卵分别置于新鲜培养基上，此时记为0 h。25 ℃继续培养，48 h后，每隔3 h观察1次，直到新卵产生，记录每条线虫从卵孵化到成虫再到产卵所需时间，即为线虫的发育周期。不同细菌每次挑选10 只线虫进行检测, 实验重复3次。

1.5 线虫寿命的测定

参照Lin等[7]的方法，将同步化的L1期线虫单个移入生长有待检细菌的平板中，25 ℃培养，直至死亡。记录线虫从开始培养直到死亡所经历的时间，即线虫的寿命。为保证有新鲜的食物，每3 d 将线虫重新转板, 所有在培养期间钻入琼脂和爬壁上死亡的线虫都不计入结果。不同细菌每次挑选10只线虫进行检测, 实验重复3次。

1.6 线虫产卵数的测定

参照Brenner等[5]的方法进行：将同步化的L4期线虫单个移入生长有待检细菌的平板中，25 ℃培养，为保证有新鲜的食物，每24 h 将线虫重新转板。记录每条线虫的总产卵量。不同细菌每次挑选3只线虫进行测定, 实验重复3次。

1.7 线虫体表细菌计数方法

参照Guha等[4]的方法进行：将同步化的线虫分别在待检细菌平板上培养至L4期，挑取10 条线虫移入1.5 mL的离心管中，加入0.5 mL的M9缓冲液涡旋震荡10 min后, 再静置5 min使线虫沉淀到管的底部，小心吸取100 μL上清液进行梯度稀释。分别取100 μL梯度稀释液涂布BHI平板，每个稀释浓度涂布3个平板，37 ℃过夜培养，记录平板上生长的细菌个数。每组实验重复3次。

1.8 线虫消化道细菌计数方法

参照Guha等[4]的方法进行：分别挑取20 只在待检细菌平板上培养传了3代的L4期线虫，置于含有60 μg/mL庆大霉素的LB平板上，25 ℃继续培养1 h杀死线虫体表的细菌后，将线虫移入1.5 mL离心管，用M9缓冲液涡旋振荡洗涤线虫。将洗涤过的线虫置于新的离心管中，加入0.5 mL M9缓冲液和100 mg石英砂，剧烈涡旋振荡5 min裂解线虫，裂解后进行梯度稀释，吸取100 μL梯度稀释液涂布BHI平板，每个稀释浓度涂布3个平板，37 ℃过夜培养，记录平板上细菌克隆个数。每组实验重复3次。

1.9 线虫粪便细菌计数

参照Guha等[4]的方法进行：分别挑取10 只在待检细菌平板上培养传了3代的L4期线虫，用含有60 μg/mL庆大霉素的M9缓冲液充分洗涤线虫，以除去线虫体表残余的细菌。然后将线虫转移到无菌BHI平板上继续培养3 h后，移走线虫，将平板置于37 ℃过夜培养，记录平板上产生的细菌个数。每组实验重复3次。

1.10 线虫对食物的趋向性

取50 μL大肠埃希菌OP50、EGDe、△prfA、+prfA和+prfA*(OD600=0.6左右)分别均匀滴加到BHI固体培养基上5个与中心点等距离的区域，37 ℃过夜培养。转移100 条同步化的L2期线虫于培养基中心，25 ℃继续培养，记录移动到各种菌上的线虫数量，连续观察12 h。实验重复3次。

1.11 数据统计分析

实验数据采用Origin 7.0 进行统计分析。显著性检验采用Student’s t-tests 方法。

2 结果与分析

2.1 培养基和抗生素对线虫生存曲线和寿命的影响

尽管Lm在自然界分布广泛，能够在包括高盐、低温和低pH等逆境中生存, 但Lm在常用细菌培养基Luria-Bertani(LB)上生长缓慢，也不能在常用的线虫培养基NGM上生长(数据未显示)。实验室通常使用营养丰富的脑心浸液BHI培养基培养李斯特菌。同时，因为LmEGDe毒力调控蛋白PrfA缺失回复株+prfA 和PrfA组成性高表达突变株+prfA*中具有表达PrfA蛋白的质粒，培养这两株细菌需要添加20 μL/mL红霉素，然而，尚未见文献明确阐述BHI培养基以及红霉素对线虫的影响，因此，在研究检测Lm对秀丽隐杆线虫的致病能力之前，有必要事先排除培养李斯特菌的BHI培养基以及红霉素对线虫生存能力的影响。如图1所示：L4期线虫在无菌的BHI平板上的生存时间与在无菌的NGM平板上相同，均为13 d；添加20 μL/mL的红霉素不影响线虫在BHI平板上的生存；而且从生存曲线来看， BHI平板还略微提高了线虫在生命中后期(第6到12天)的生存率。同时，当以大肠埃希菌OP50为食源时，线虫在BHI和NGM平板上的寿命分别是15.2和15.5 d(参见2.2.1结果)，也没有显著变化。以上实验表明：BHI培养基和浓度为20 μL/mL的红霉素不影响线虫的生存和寿命，在后续实验中可以忽略BHI培养基以及红霉素对线虫的作用。

图1 培养基和抗生素对线虫生存时间的影响Fig.1 The survival curves of C. elegans on NGM and BHI plates with (BHI with Em) or without 20 μL/mL of erythromycin

2.2 单核细胞增生李斯特菌对线虫的致病能力

无害李斯特菌(L.innocua)的基因组与单核细胞增生李斯特菌的基因组具有高度的保守性和共线性，但因其不具有PrfA以及相关毒力因子，对人畜无致病能力[8]。本实验在使用大肠埃希菌OP50作为参照的同时，也选择了无害李斯特菌作为实验对照，比较研究了Lm野生株EGDe及其3种PrfA突变株(即弱毒力株△prfA、毒力回复株+prfA和高毒株+prfA*)对线虫发育周期、寿命和产卵数的影响，从而确定Lm对线虫是否有致病作用。

2.2.1 单核细胞增生李斯特菌和无害李斯特菌对线虫发育周期、寿命和产卵数的影响 如表1，当以无害李斯特菌、Lm野生株以及PrfA突变株为食时，线虫不仅能够正常产卵，而且其发育周期和寿命均较以OP50为食时显著延长(P≤0.05)，特别是高毒株+prfA*有极显著的延长作用(P≤0.01)；线虫的产卵数虽有不同程度降低，但以各种李斯特菌为食时，均能正常产卵，而且，Lm野生株和无害李斯特菌对线虫产卵数的影响并不显著(P>0.05)，但弱毒株△prfA和高毒株+prfA*却显著降低了产卵数(P≤0.05)；更为重要的是，本实验所使用的Lm野生株和PrfA突变株(弱毒力株△prfA、毒力回复株+prfA和高毒株+prfA*)均是文献报道并被确认的具有显著毒性差异的Lm菌株，但这些菌株对线虫发育周期、寿命和产卵数的作用趋势完全一致，表明李斯特菌毒力基因的不同表达对线虫没有显著差异作用，线虫不是研究单核细胞增生李斯特菌致病机制的良好模型。

表1 单核细胞增生李斯特菌和无害李斯特菌对线虫发育周期、寿命和产卵数的影响

注：a、b表示与用大肠埃希菌OP50喂饲的线虫相比，无害李斯特菌和4种单核细胞增生李斯特菌喂饲的线虫在发育周期、寿命和产卵数方面的差异显著性，其中a≤ 0.05，b≤ 0.01；c、 d表示用△prfA、+prfA和+prfA*喂饲的线虫相对于野生株EGDe喂饲的线虫在发育周期、寿命和产卵数方面的差异显著性，其中c≤ 0.05, d≤ 0.01

2.2.2 线虫虫龄对单核细胞增生李斯特菌致病性的影响 在以线虫为模型研究病原细菌致病性的实验中，通常采用L4期线虫。因为L4期线虫处于线虫发育生命周期的晚期，其免疫能力可能较弱，易受致病菌的感染[4]。为了检验虫龄是否影响李斯特菌的致病能力，比较了Lm野生株EGDe和高毒力突变株+prfA*喂饲L4期和L2期线虫时生存曲线的差异。如图2所示，无论是以EGDe还是以+prfA*为食，处于发育周期中期的L2期线虫的生存时间均比L4期线虫略长，生存率增加，说明线虫的虫龄对线虫的生存长短有重要影响。但是，高毒力的+prfA*喂饲L4期线虫时的生存率却明显比野生株EGDe喂饲L2期线虫时要高，表明高毒力的Lm不能破坏线虫的免疫机制，单核细胞增生李斯特菌的毒性高低与线虫虫龄大小没有相关性，线虫虫龄对李斯特菌的致病能力没有影响。

图2 单核细胞增生李斯特菌EGDe和+prfA*喂饲L4期和L2期线虫时的生存曲线Fig.2 The survival curves of middle-aged (L2) and elderly worms (L4) fed on L. monocytogenes EGDe and +prfA*

2.2.3 单核细胞增生李斯特菌喂饲线虫时，线虫体表、消化道和粪便中的细菌数 研究表明，当用大肠埃希菌OP50喂饲线虫时，OP50首先被线虫咽的表皮结构磨碎后吞食，线虫的肠内看不到完整的大肠埃希菌，也不能在线虫的消化道检出完整的细菌[1]。尽管以上实验表明Lm不能致死线虫，甚至能显著延长线虫的发育周期和寿命，但Lm与线虫的相互关系，以及Lm能否作为线虫的良好食源且被线虫消化完全，还需进一步实验。

表2 单核细胞增生李斯特菌喂饲线虫时，线虫体表、消化道和粪便中的细菌数

注：a、b表示与野生型EGDe相比，用△prfA和+prfA*喂饲线虫时，线虫体表、消化道和粪便中细菌数的差异显著性，其中a≤ 0.05，b≤ 0.01

如表2所示，当用Lm野生株EGDe、弱毒株△prfA和高毒力突变株+prfA*喂饲线虫后，从线虫体表可以发现大量的细菌，其中以+prfA*最多，而△prfA最少；当经过60 μg/mL庆大霉素的充分处理，去掉了未被摄食的体表李斯特菌后，从线虫消化道中仍然可以检出大量活细菌，其中EGDe的数量最多，而+prfA*最少；但当与线虫体表和消化道中检出的活菌数相比，线虫粪便活细菌数大为减少。以上结果表明：线虫能够以Lm为食；Lm被线虫摄食后，并不被立即完全消化，可以在线虫消化肠道中存活一段时间；Lm毒性强弱与在线虫体表和消化肠道的生存没有相关性。

3 讨 论

在人类病原细菌致病机制的基础研究中，选择合适的模式宿主至关重要。近年来，秀丽隐杆线虫以其背景资料丰富、便于操作和观察、廉价等特点，成为研究者关注的热点，但唯有病原菌可以对线虫致病，线虫才有可能作为研究病原菌致病性的模型。本实验以秀丽隐杆线虫N2的良好食源大肠埃希菌OP50以及无害李斯特菌为参照，比较研究了食源性致病菌单核细胞增生李斯特菌EGDe及其毒力调控蛋白PrfA突变株对秀丽隐杆线虫N2的致病作用。研究发现与无害李斯特菌一样，Lm及其PrfA突变株不仅不能使线虫死亡，而且还能显著延长线虫的发育周期和寿命，这在一定程度上暗示Lm对秀丽隐杆线虫没有显著致病性，不适合作为研究Lm致病机制的模型。

Lm对秀丽隐杆线虫非致死性，是否是因为培养线虫的温度(25 ℃)不适合Lm毒力基因的表达？已知的研究证明，Lm在环境温度低于30 ℃时侵染能力较低， 可能是因为从prfA 启动子P1转录合成的mRNA非翻译5′端 (untranslated 5′-region)在温度低于30 ℃时，能折叠形成二级结构, 掩盖了核糖体结点，从而阻碍PrfA的合成；而在温度高于30 ℃时，不能形成二级结构，PrfA能够顺利合成，这就是所谓的“核糖体开关机制”[9]。该发现能够解释Lm毒力基因在自然界和感染宿主后差异表达的现象。即：当Lm在土壤环境(一般为室温25 ℃左右)中以腐烂的植物为营养进行腐生生活时，毒力基因表达量较低；而当Lm侵染入人体细胞后(一般为37 ℃)，毒力基因表达大大提高。然而，尽管Lm主要的危害是造成人和牲畜的李斯特菌病，但该菌还能侵染大蜡螟和果蝇等生活环境温度通常在30 ℃以下的昆虫及其细胞系，暗示：“核糖体开关机制”不能完全诠释Lm毒力基因表达调控的机制，温度不是影响Lm对秀丽隐杆线虫非致死性的唯一原因。

另外，研究发现，改变PrfA蛋白链上的关键氨基酸的组成也可以影响PrfA的活性，进而增强或者降低依赖PrfA调控的毒力基因的表达。本实验中所采用的PrfA突变株+prfA*就是PrfA上第145位的甘氨酸替换为丝氨酸后产生的突变株，该突变极大地增强了PrfA与靶DNA的结合能力，导致PrfA的活性不再受温度等培养条件的影响，使PrfA蛋白组成性高表达[9]，从而大大提高了突变株的致病能力。然而，本研究结果却显示，+prfA*和Lm野生株以及PrfA缺失株一样，不仅不能造成秀丽隐杆线虫死亡，反而能极其显著地延长线虫的发育周期和寿命，说明这些在动物毒理实验中已知高毒性的Lm菌株对线虫没有显著致病性，再次证明了线虫不是研究单核细胞增生李斯特菌致病机制的良好模型。

实验中发现可以从线虫消化道检出大量活Lm细菌，而在粪便中检出的活菌极少，表明线虫可以以Lm为食，但与线虫的良好食源大肠埃希菌OP50不同，Lm被线虫摄食后，似乎并不被立即磨碎消化，而能在消化道存活一段时间，直到被完全消化而排出细胞残渣，暗示Lm并不是线虫的良好食源，这也与本研究观察到的线虫喜食大肠埃希菌OP50的结果一致(移动到OP50的线虫数目大约是移动到李斯特菌的线虫数目的6倍)。因此，当线虫以Lm为唯一食源时，线虫可能因不喜食用李斯特菌而处于一定程度的饥饿状态，而这种饥饿状态已被证明可以延长线虫的发育周期和寿命[10]。同时，由于Lm和线虫均能在土壤环境中广泛存在，Lm对线虫的非致死性，也可能有助于Lm借助线虫在土壤环境中生存和传播。因此，鉴于Lm在食品卫生安全中的重要影响以及线虫在模式生物研究中的作用，进一步深入研究线虫与Lm的相互关系将对解析食源性致病微生物在自然环境中的进化和传播机制具有重要意义。

[1] 徐冬蕾, 阚飙. 秀丽隐杆线虫作为研究病原细菌致病机制的新模型[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2010, 21(3): 283-285.

[3] Thomsen LE, Slutz SS, Tan MW, et al.Caenorhabditiselegansis a model host forListeriamonocytogenes[J]. Applied and environmental microbiology. 2006, 72(2): 1700-1701.

[4] Guha S, Klees M, Wang X, et al. Influence of planktonic and sessileListeriamonocytogenesonCaenorhabditiselegans[J]. Archives of microbiology, 2013, 195(1): 19-26.

[5] Brenner S. The genetics ofCaenorhabdztzselegans[J]. Genetics, 1974, 77(1): 71-94.

[6] 冯飞飞, 张强, 王莉, 等. 毒力基因调控蛋白 PrfA促进单核细胞增生李斯特菌生物被膜的形成[J]. 微生物学通报, 2011, 38(9): 1450-1457.

[7] Lin YT, Hoang H, Hsieh SI, et al. Manganousion supplementation accelerates wild type development, enhances stress resistance, and rescues the life span of a short-livedCaenorhabditiselegansmutant[J]. Free radical biology and medicine, 2006, 40(7): 1185-1193.

[9] 罗勤, 张晓莉, 李兵, 等. 单核细胞增生李斯特菌PrfA蛋白转录调控毒力基因表达的分子机制[J]. 微生物学通报, 2008, 35(2): 275-280.

[10]沈露露,王大勇.秀丽线虫衰老调控的生理与分子机制[J].生理科学进展,2009,40(1):75-78.

Pathogenicity of Listeria monocytogenes against Caenorhabditis elegans

GUO Xin-xin, YU Xin-hui, ZHANG Ying, LUO Qin

(HubeiKeyLab.ofGen.Regulat’n&Integrat.Biol.,Coll.ofLifeSci.,Cent.ChinaNormalUni.,Wuhan430079)

Listeriamonocytogenes(Lm) is a pathogenic bacterium of listeriosis. In this study wild type ofLmEGDe, attenuated strain ΔprfA, PrfA complementary strain +prfA, and a highly virulent strain +prfA*were fed respectively to model organism ofCaenorhabditiselegans(Ce) N2, at the same time, fine food resource ofE.coliOP50 and non-pathogenic and unharmfulL.innocuawas also fed to the model of Ce as a control, to determine the effect ofLmon the development circle, life-span and brood ofC.elegans. The results showed that when fed on unharmfulL.innocua, wild-typeLmEGDe and its PrfA mutant strains, although the brood was slightly decreased, however, the nematode not only could normally oviposit, but also the development period and life-span ofC.eleganswere significantly extended (P≤0.05) as compared with those fed onE.coliOP50. Furthermore, a large number of liveLmcells were detected from the worms’ surface and digestive tract, but only a few bacteria were detected in the worms’ excrements. The above results indicated thatLmneither can kill Ce nor have significant pathogenicity against Ce, therefore,C.elegansis not a suitable model to study Listeria pathogenicity.C.eleganscan exist inLmbody surface and digestive tracts, suggested thatLmcould exist and spreading in soil environment with the aid of nematode.

Listeriamonocytogenes;Caenorhabditiselegans; PrfA; Pathogenicity; model system

国家自然科学基金项目(30970111，31571931)

郭欣欣 女，硕士研究生。主要研究方向为微生物分子生物学。E-mail:939209685@qq.com

* 通讯作者。女，博士，副教授，硕士研究生导师。主要研究方向为病原微生物。Tel: 027-67867221，E-mail:qinluo@mail.ccnu.edu.cn

2014-06-16；

2014-09-04

Q939.96

A

1005-7021(2015)04-0007-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.002